[发明专利]高表达烟碱嵌合基因、其表达载体及应用

权利要求书

1.一种高表达烟碱嵌合基因，含有烟碱NtPMT1启动子和与其可操作连接的、编码目的基因的序列；所述烟碱NtPMT1启动子的核苷酸序列为：

（1）如SEQ ID NO.1所示；或

（2）在如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的基础上，加倍含G-box元件的序列ATGCACGTTGTAAT。

2.根据权利要求1所述的高表达烟碱嵌合基因，其特征在于，所述加倍的倍数为2-10。

3.根据权利要求1所述的高表达烟碱嵌合基因，其特征在于，所述烟碱NtPMT1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求3所述的高表达烟碱嵌合基因，其特征在于，所述目的基因为GUS 基因或PMT1基因。

5.根据权利要求3所述的高表达烟碱嵌合基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

6.一种表达载体，含有权利要求1所述高表达烟碱嵌合基因。

7.一种工程菌，含有权利要求1所述高表达烟碱嵌合基因。

8.权利要求1所述高表达烟碱嵌合基因、权利要求6所述表达载体或权利要求7所述工程菌在调控烟草烟碱生物合成或培育高表达烟株中的应用。

9.一种提高烟草烟碱生物合成量的方法，包括如下步骤：

（1）合成权利要求1中所述烟碱NtPMT1启动子，并将插入pCAMBIA-NPT-GUS载体的EcoR I和Hind III位点替换35S启动子，得到植物表达载体pCAMBIA-NPT-NtPMT1-GUS；

（2）以烟草 cDNA为模板，以林烟草PMT1-mRNA序列设计引物扩增出PMT1基因CDS序列；

（3）用Spe I和BstE II双酶切步骤（1）中所得植物表达载体，将步骤（2）扩增得到的NtPMT1基因连接至pCAMBIA-NPT-NtPMT1 -GUS载体的Spe I和BstE II位点，替换原有的GUS基因，获得重组质粒；

（4）将上步所得重组质粒采用农杆菌转化法转入烟草植株中，经卡那霉素抗性筛选阳性植株，经生根培养后进行正常移栽。