[发明专利]一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法

说明书

本发明公开了第一步，取西瓜汁：通过在西瓜田中随机挑选一些西瓜，通过取汁装置将西瓜去皮与去籽，得到5‑10ml的西瓜汁；第二步，西瓜汁预处理：通过高速离心去掉西瓜汁上清，留沉淀样品，以无菌操作将沉淀样品转入培养基中，室温培养一段时间；第三步，提取培养后样品中的DNA；第四步，利用PCR检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的西瓜果斑病菌。本发明通过取汁装置快速获得样品后即可进行检测，而且可快速、可靠地提取到用于PCR快速检测西瓜果斑病菌技术所需的DNA，可用于西瓜果斑病菌的快速及时诊断，对该病害的预防和及时防治具有十分重要的意义。

技术领域

本发明涉及西瓜细菌性果斑病检测技术领域，尤其涉及一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法。

背景技术

西瓜细菌性果斑病又称细菌斑点病、西瓜水浸病、果实腐斑病等，是西瓜、籽瓜风险最高的一种种子传播病害。苗期和成株均可发病。瓜苗染病沿中脉出现不规则褐色病变，有的扩展到叶缘，从叶背面看呈水渍状，有时被一个黄色组织带包围。种子带菌的瓜苗在发病后1-3周即死亡。西瓜果实染病，初期在果实上部表面现数个几毫米大小灰绿色至暗绿色水渍状斑点，后迅速扩展成大型不规则的水浸状斑，3～5天内便布满除接触地面部分的整个果面。早期形成的病斑老化后表皮龟裂，常溢出黏稠、透明的琥珀色菌脓，果实很快腐烂。该病多始于成瓜向阳面，与地面接触处未见发病，瓜蔓不萎蔫，西瓜细菌性果斑病的病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种。该菌属原核生物界、薄壁菌门、暗细菌纲、假单孢菌科、嗜酸菌属。

传统的病原菌检测技术是在分离和进行进一步的培养从而获得相应病原物的基础上，通过形态学观察和科赫氏法则来判断病原物的种类。但是，分离，培养全部过程往往都非常消耗时间以及需要大量的劳动力资源。如何快速准确的鉴定西瓜是否含有西瓜细菌性果斑病是西瓜健康种苗生产的关键技术之一，也是甘西瓜健康种苗能否推广的保障。因此，生产上迫切需要一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法。

发明内容

本发明提供了一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，包括以下步骤：

第一步，取西瓜汁：通过在西瓜田中随机挑选一些西瓜，通过取汁装置将西瓜去皮与去籽，得到5-10ml的西瓜汁；

第二步，西瓜汁预处理：通过高速离心去掉西瓜汁上清，留沉淀样品，以无菌操作将沉淀样品转入培养基中，室温培养一段时间；

第三步，提取培养后样品中的DNA；

第四步，利用PCR检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的西瓜果斑病菌。

作为本技术方案的进一步改进方案：第一步中，挑选西瓜时，选择西瓜刚成熟期进行检测。

作为本技术方案的进一步改进方案：第二步中，培养基为2×YT培养基。

作为本技术方案的进一步改进方案：第二步中，室温培养时间为6-8小时。

作为本技术方案的进一步改进方案：第三步中，提取培养后样品中的DNA具体为：

S1,将2ml的沉淀样品中加入300ul裂解液，30mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，10mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；

S2,然后加入100ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；

S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；