[发明专利]一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法

权利要求书

1.一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，取西瓜汁：通过在西瓜田中随机挑选一些西瓜，通过取汁装置将西瓜去皮与去籽，得到5-10ml的西瓜汁；

第二步，西瓜汁预处理：通过高速离心去掉西瓜汁上清，留沉淀样品，以无菌操作将沉淀样品转入培养基中，室温培养一段时间；

第三步，提取培养后样品中的DNA；

第四步，利用PCR检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的西瓜果斑病菌。

2.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，第一步中，挑选西瓜时，选择西瓜刚成熟期进行检测。

3.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，第二步中，培养基为2×YT培养基。

4.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，第二步中，室温培养时间为6-8小时。

5.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，第三步中，提取培养后样品中的DNA具体为：

S1,将2ml的沉淀样品中加入300ul裂解液，30mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，10mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；

S2,然后加入100ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；

S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；

S4,加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。

6.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，第三步中，提取培养后样品中的DNA具体为：

S1,将2ml的沉淀样品中加入400ul裂解液，40mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，20mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；

S2,然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；

S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；

S4,加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。

7.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，第三步中，提取培养后样品中的DNA具体为：

S1,将2ml的沉淀样品中加入500ul裂解液，50mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，30mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；

S2,然后加入300ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；

S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；

S4,加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。