[发明专利]一种鉴定烟草腺毛密度的DNA分子标记及其应用

权利要求书

1.一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记的引物，其特征在于，所述引物包括以下上游引物和下游引物：

上游引物W12-seq-F：5’-GACAGGGGAGATTATTCAAAA-3’；

上游引物W12-WT-F：5’-CACCACGAGTGATCAACCACC-3’；

公共下游引物W12-R：5’-TTGAAAAACAGGGCTAGAGGG-3’。

2.一种包含权利要求1所述的鉴定烟草腺毛密度的分子标记的引物的试剂盒。

3.一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)引物组合成：合成如权利要求书1所述的引物W12-seq-F、W12-WT-F以及W12-R；

(2)DNA的提取：提取烟草叶片的基因组DNA；

(3)PCR扩增：基于上述烟草叶片基因组DNA，使用步骤(1)合成的引物进行PCR扩增，引物组合分别为W12-seq-F+W12-R和W12-WT-F+W12-R，预先加入两个已经确定为高腺毛密度和低腺毛密度且基因序列已知的样本DNA作为对照；

(4)扩增产物检测与分析：

直接测序：对于W12-seq-F+W12-R引物组合扩增的产物，直接进行测序，若所测DNA片段135-141bp位置的7-bp缺失，即与SEQ ID NO.4序列相同，则为高腺毛密度单株；若所测DNA片段135-141bp位置的没有缺失，即与SEQ ID NO.5序列相同，则为低腺毛密度单株；若测序峰图为套峰，为低腺毛密度单株；

琼脂糖凝胶检测：对于W12-WT-F+W12-R引物组合的扩增产物进行琼脂糖凝胶检测，若W12-WT-F+W12-R引物组合不能扩增出条带，则为高腺毛密度单株；若W12-WT-F+W12-R引物组合能扩增出条带，则为低腺毛密度单株。

4.根据权利要求3所述的鉴定烟草腺毛密度的分子标记的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增反应体系为：50ng/μL的样品基因组DNA模板1.0μL，2×EASY Taq mix 10μL，10μM的上下游引物各0.4μL，ddH₂O补足至20μL。

5.根据权利要求3所述的鉴定烟草腺毛密度的分子标记的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增程序为：95℃预变性5min，然后95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环，最后72℃ 10min。

6.一种根据权利要求1所述的引物、根据权利要求2所述试剂盒或根据权利要求3-5任一所述的方法在烟草育种中的应用。

7.一种根据权利要求1所述的引物、根据权利要求2所述试剂盒或根据权利要求3-5任一所述的方法在筛选烟草不同腺毛密度单株中的应用。