[发明专利]基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法及其应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了一种基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法及其应用。所述方法包括：将细胞外囊泡EVs与抗体核酸复合物一起孵育得到EVs检测复合物，然后将EVs检测复合物、引物、探针与EVs裂解液配制成信号反应体系在液滴微流控芯片上产生微液滴，微液滴中裂解释放其内部的核酸分子，EVs膜上的抗体核酸复合物经PCR扩增反应产生荧光信号，EVs释放的mRNA经RT‑PCR反应产生荧光信号；随后将微液滴转移至液滴分析芯片，通过液滴分析仪识别读取实现单个EV内核酸和膜蛋白标志物联合检测的数字化分析，对相关疾病的早期诊断效能评估具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法及其应用。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是细胞通过内吞外排或膜融合等途径，向细胞外环境释放的粒径不均一的具有脂质双分子层膜的囊泡，并且广泛存在于各种体液中，包括血液、尿液、脑脊液等。EVs可被所有有核细胞分泌，具有不同的生物起源、形态大小和密度，展现了巨大异质性，尤其是其携带丰富多样的可以反映亲本细胞生理或病理状态的蛋白和核酸标志物。近年来，越来越多的研究表明EVs蛋白和核酸可作为多种疾病的标志物，包括恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等。因此，精准的分类分析这些携带特异蛋白和核酸标志物的EVs亚群是目前的研究热点。

目前，已有大量研究报道了一些特异EVs亚群检测技术，如基于比色、荧光和电化学生物传感技术等。然而，这些技术大多是批量分析技术，忽略了EVs个体的差异，并且灵敏度低，针对疾病早期特异EVs含量少，无法检测，不利于疾病的早期诊断。因此，开发一个超灵敏的，可以在单囊泡水平上实现EVs精准分析的检测新技术用于疾病诊断具有一定的临床需求。

针对单个EV的检测技术的研究进展可大致概括为三方面：一、传统检测技术，如透射电镜、原子力显微镜、纳米粒子跟踪分析等，这些常用于EVs的表型鉴定；二、光电学技术，包括超分辨荧光显微镜、全内反射荧光显微镜、纳米流式细胞术、拉曼光谱等，这些技术均需昂贵的仪器，不利于临床应用的推广；三、微流控技术，包括连续型微流控和非连续型微流控技术(微液滴或微孔)，具有集成化，智能化，便携化，具有广阔的临床应用前景。申请人研究团队更加关注液滴微流控技术，它是基于两相不相容的原理，油相提供稳定的剪切力将水相分散成一个个独立的液体反应单元，可以实现稀有靶标的数字化检测。在前期相关工作中，申请人研究团队实现了特异蛋白的单个EV数字化检测，但是该技术仅能对EVs蛋白分子实现检测，不能用于EVs核酸标志物(Liu C^#,Xu X^#,Li B,Situ B,Pan W,Hu Y,An T,Yao S^*,Zheng L^*,Single-Exosome-Counting Immunoassays for CancerDiagnostics.Nano Letters, 2018,18(7):4226-4232.)。EVs蛋白标志物反应的是功能执行层面的信息，而核酸标志物反应的是基因表达调控层面的信息，在临床检验应用中，标志物的联合检测可以提高疾病的诊断效能。因此，将EVs蛋白和核酸标志物联合检测可以从不同的功能维度上为疾病诊断提供更全面的信息，提高疾病的诊断效能。目前，针对EVs蛋白和核酸联合检测已有文献报道，近年来也逐渐从批量分析向单个EV分析转化，但是基于液滴微流控技术的单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物联合检测仍未见报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法及其应用，为临床上相关疾病的诊断提供新的技术手段。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法，包括如下步骤：