[发明专利]基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法及其应用

权利要求书

1.一种基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法，其特征在于，包括如下步骤：将细胞外囊泡EVs与抗体核酸复合物一起孵育得到EVs检测复合物，所述抗体偶联核酸复合物由细胞外囊泡普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成；然后将EVs检测复合物、引物、探针与EVs裂解液配制成信号反应体系在双液相通道的液滴微流控芯片上产生微液滴，包裹了EVs检测复合物的微液滴中的裂解液将EVs原位裂解，释放其内部的核酸分子，EVs膜上的抗体核酸复合物在热循环仪中经PCR扩增反应产生荧光信号，EVs释放的mRNA经RT-PCR反应产生荧光信号；随后将微液滴转移至液滴分析芯片，通过液滴分析仪识别读取实现单个EV内核酸和膜蛋白标志物联合检测的数字化分析。

2.根据权利要求1所述的数字化分析方法，其特征在于：所述细胞外囊泡EVs从细胞上清液提取而得，或来源于血液/血浆样本；

和/或，所述抗体核酸复合物由细胞外囊泡EVs普适性表达和/或特异的亲和素化抗体与生物素化核酸链偶联而成；

和/或，细胞外囊泡EVs普适性表达的抗体选自CD9、CD63、CD81中的至少一种，细胞外囊泡EVs特异的抗体选自HER2，所述核酸模板链选自T1、T2、T3中的至少一种所述T1、T2、T3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10所示；和/或，所述引物选自Forward primer1与Reverse primer1、Forward primer2与Reverse primer2、Forwardprimer3与Reverse primer3中的至少一种组合，所述Forward primer1、Reverse primer1、Forward primer2、Reverse primer2、Forward primer3与Reverse primer3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12所示；

和/或，所述探针选自Probe1、Probe2、Probe3中的至少一种，所述Probe1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4所示，所述Probe2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，所述Probe3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13所示。

3.根据权利要求2所述的数字化分析方法，其特征在于：所述细胞上清液来源于乳腺癌细胞，所述血液/血浆样本来源于乳腺癌患者。

4.根据权利要求2所述的数字化分析方法，其特征在于：所述抗体核酸复合物与引物、探针选自以下组合方式中的至少一种：

(1)CD9-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；

(2)CD63-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；

(3)CD81-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；

(4)HER2-T3复合物、Forward primer3、Reverse primer3与Probe3。

5.根据权利要求1所述的数字化分析方法，其特征在于：裂解条件如下：EVs裂解液TritonX-100浓度为0.05～1％，裂解温度为4～42.7℃，裂解时间为20～60min；

和/或，所述PCR扩增反应程序如下：①50℃：15min；②95℃：5min；③95℃：30s；④54～64℃：1min；③+④：45cycles。

6.一种多重检测体系，其特征在于：包括细胞外囊泡EVs和抗体核酸复合物EVs检测复合物、引物、探针、裂解液，所述EVs检测复合物由细胞外囊泡EVs与抗体核酸复合物一起孵育而得，所述抗体核酸复合物由细胞外囊泡(EVs)普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成。