[发明专利]一种样本核酸检测和中和的方法

说明书

本发明提供一种样本核酸中和和检测方法，所述方法包括：利用核酸提取液提取样本中的核酸，获得样本核酸溶液；将中获得的样本核酸溶液与PCR反应液混合在一起得到混合液，利用所述混合液进行扩增反应，检测样本中的核酸；所述PCR反应液比所述核酸提取液中的pH值低。本发明利用PCR反应液对提取出的样本核酸进行中和，而不是在核酸提取时进行中和，可有效提高核酸提取效率和PCR扩增效率，显著提高样本核酸检测的准确性和灵敏度。

本申请是名称为一种样本核酸检测试剂盒、试剂及其应用，申请号为201710291332.3的分案申请。

技术领域

本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种样本核酸检测方法和中和样本核酸的方法。

背景技术

随着分子生物学技术的快速发展，它已经渗透到生物学、医学、植物学、遗传学和动物学等各个方面。作为分子生物学技术的一项重大突破，聚合酶链式反应(PCR)技术具有高灵敏度、高特异性和省时快速等特点，已广泛地运用于人类和动物的疾病诊断(如产前诊断、新生儿筛查以及遗传代谢疾病检测)、法医侦检、亲缘关系分析、种子纯度鉴定、分子标记辅助育种、基因定位和转基因生物检测等等。

运用PCR技术进行检测主要涉及到三个方面：核酸提取、核酸扩增和扩增产物检测。核酸提取的质量与数量通常直接决定着PCR反应的成败。因此，大量基于PCR技术的检验方法(如荧光PCR、DNA测序和RNA测序等)需要在扩增前提取与纯化生物样本(如血清、血浆、全血、尿液、阴道分泌物、唾液、粪便、棉拭子、上皮脱落细胞、新鲜组织和石蜡组织切片等)中的DNA和/或RNA核酸分子。

长期以来，生物样本中核酸的提取和纯化一直是耗时、繁琐的过程，严重减慢了检测速度。尤其是对极其微量的生物样本而言，常规的核酸提取方法对样本中微量DNA的提取回收率低是导致后续PCR扩增效果差的主要原因。因此，建立一种快速的DNA提取方法对提高PCR检测效率是至关重要的。

根据核酸的不同性质，有非常多的提取方法，其中一种比较常用的方法就是基于Chelex-100的煮沸法，即Chelex-100煮沸法。在这种煮沸法中，Chelex-100是一种苯乙烯和苯二乙烯共聚体组成的化学离子螯合树脂，其悬液在碱性环境(pH 10～14)和100℃的条件下，可导致细胞膜破裂，并使DNA变性后从细胞核中释放出来，并且Chelex-100可高选择性地结合多价阳离子，去除样本和缓冲液中的多价金属离子，避免煮沸过程中核酸模板发生降解，此外它还能够有效除去非核酸有机物，具有经济、简便、高效等优点，可以减少提取过程中核酸的损失，目前已被广泛用于微量血液、组织斑块、精斑、毛发和骨骼等法医物证检材的核酸提取中。

Chelex-100煮沸法主要分为三个步骤：生物样本浓缩；加入裂解液，高温煮沸；高速离心，取上清液，即为所提取的核酸溶液。在煮沸法中，裂解液除了含有Chelex-100之外，还含有NaOH或KOH，从而确保它的pH值保持在10～14。这也因此导致所提取的核酸溶液维持较强的碱性。这种较强的碱性如果不加以中和的话，直接与PCR反应液混合在一起进行扩增反应，那么会导致PCR扩增反应效率低下。为了解决这个问题，中国专利申请CN201110295395.9在加入裂解液进行高温煮沸后，加入200mM Tris-HCl缓冲液(pH 6.8～7.5)进行中和，从而降低所提取的核酸溶液中的pH值。然而，当利用这种方法提取生物样本中的核酸时，需要手工加入中和液进行中和，操作步骤有些繁琐，如果操作人员忘记加入的话，将会降低PCR扩增效率，影响检测结果。

此外，还有一种常用的核酸提取方法就是碱裂解法。中国专利申请CN201210242862.6利用强碱溶液(如NaOH或KOH溶液)在高温下让生物样本中的细胞发生裂解，释放出核酸，然后加入酸性缓冲液进行中和，进行离心，获得所提取的核酸溶液。同样地，当利用这种方法提取生物样本中的核酸时，需要手工加入中和液进行中和，操作步骤有些繁琐，如果操作人员忘记加入的话，将会降低PCR扩增效率，影响检测结果。