[发明专利]一种细胞交叉污染检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种细胞交叉污染检测方法，包括如下步骤：S1：制备细胞交叉污染样本，并进行细胞DNA提取；S2：根据位点信息设计引物建立多重PCR扩增体系；S3：文库构建成功后进行高通量测序分析；S4：按照判定标准，确认细胞是否存在交叉污染。本发明通过高通量测序技术对微单倍型进行分析，能够获得微单倍型复合体系中SNP位点的全部基因分型，具有速度快、准确可靠性高、集成化等优点。本发明可适用于细胞制剂的质量控制和细胞库对储存细胞系质量的监测。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种细胞交叉污染检测方法及应用。

背景技术

细胞交叉污染(cell cross-contamination)是指细胞在分离、培养和使用过程中，混入了来源于种属内或种属外的非目标细胞而造成的污染。1952年第一株人源细胞系HeLa细胞系被成功建立，从此细胞培养成为生物医药产业发展不可或缺的工具。伴随着细胞培养的广泛应用，细胞错误鉴定或培养物交叉污染逐渐成为一个长期困扰的问题。据统计全球广泛使用的细胞系中有超过400种细胞系经证实被错误鉴定或交叉污染，在美国、欧洲和亚洲等实验室中至少有20％存储的细胞系被错误鉴定或交叉污染。2016年中国科学院昆明细胞库公布在其储存的细胞中发现61种错误鉴定和污染的细胞系。经国家生物医学实验细胞资源库检测，截止2020年3月，共发现107种错误细胞系，其中47种属于建系过程中被污染。而对来自中国22个机构的278种细胞系进行检测，发现有46％的细胞系(128/278)被错误鉴定/交叉污染，其中由中国研究者建立的细胞系中有73.2％(52/71) 被错误鉴定。交叉污染或细胞系身份错误识别而导致的研究结论错误问题，对科研以及生产、临床应用等造成了严重危害。因此，确保细胞系身份真实且不存在交叉污染，是生产用细胞基质以及治疗用细胞产品的关键质控指标。原国家卫生与计划生育委员会、原国家食品药品监督管理总局于2015年发布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》和2017年发布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行)》，也明确指出临床用细胞或细胞治疗产品应进行细胞鉴定，确定细胞无交叉污染。但目前仍缺乏可靠的细胞交叉污染检测体系，迫切需要开发具有更高灵敏度和更具特异性的细胞交叉污染检测新技术。

单倍型(haplotype)是指在一条染色体上，紧密连锁的多个等位基因的线性组合，每一种组合方式可视为一种单倍型。与基因类似，单倍型是具有统计学关联性的遗传标记，可由多个单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms,SNP)位点构成，包含丰富的遗传信息，研究单倍型比研究单个SNP位点效果更佳。2013年Kidd教授首次提出微单倍型(microhaplotype)概念，微单倍型的片段长度更短， 200bp范围内可包含2～4个SNP。微单倍型是由SNP线性排列而成，但它具有其独特性，并克服了SNP的缺点，具体表现在：高度多态性、较低突变率、检测方法背景影响小、适用于混合样本和降解样本检测、序列跨度小且长度均衡，能较大程度避免扩增不平衡问题。作为一种新型遗传标记，微单倍型为祖源推断、个体识别及亲子鉴定、法医学以及遗传学相关研究等领域提供了一种新的选择。