[发明专利]一种转氨酶突变体及其工程菌与应用

说明书

本发明公开了一种转氨酶突变体及其工程菌与应用，所述转氨酶突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第241位氨基酸经单点突变而获得。本发明提供了一种来源于沙门氏菌新的高活力转氨酶突变体，酶活可达79.81U/(mg蛋白)。所述转氨酶突变体能够生物催化2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]‑丁酸制备L‑草铵膦，200mM底物反应3h，底物转化率为83.19％，产物ee99.9％，相比于原始酶，转化率提高了2.23倍，在生产L‑草铵膦中具有较好的应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种S型转氨酶突变体及其编码基因，以及其在微生物催化底物2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸不对称合成L-草铵膦中的应用。

(二)背景技术

草铵膦是由原德国艾格福公司(后归属拜耳公司)在20世纪80年代开发成功的一种广谱触杀型灭生性除草剂。草铵膦属于膦酸类除草剂，能够抑制植物氮代谢途径中的谷氨酰胺合成酶，从而干扰植物的代谢，使植物死亡。

草铵膦具有杀草谱广、低毒、活性高和环境相容性好等特点，其发挥活性作用的速度比百草枯慢而优于草甘膦，成为与草甘膦和百草枯并存的非选择性除草剂，应用前景广阔。许多杂草对草铵膦敏感，在草甘膦产生抗性的地区可以作为草甘膦的替代品使用。外消旋草铵膦才具有除草活性，且能在土壤微生物的作用下迅速降解。草铵膦的半衰期约为3-7天，对人畜毒性小，对环境破坏力小。若只使用仅含L-构型草铵膦(L-PPT)的产品，不仅使草铵膦的用量降低50％，减少药害，同时也减缓了杂草产生抗药性的进程，延长农药的使用寿命。由此，越来越多的研究转向了L-构型草铵膦的生产。

L-PPT的合成方法主要分为化学法和生物法。化学法合成L-PPT主要分为低温定向合成法、不对称催化加氢合成法、不对称氰基加成法、不对称Michael加成反应。化学法具有原子经济性高的特点，但其反应条件往往比较苛刻，对设备的要求比较高。生物法不对称合成L-PPT因具有立体选择性高、反应条件温和以及环境污染小等优点而备受关注。迄今为止，尽管化学法合成L-PPT的方法很普遍。但是化学合成L-PPT通常步骤冗长，合成路线复杂，产率和对映体选择性比较低。相比与化学法合成L-PPT，生物酶法具有严格的立体选择性、催化体系简单、催化条件温和、产率高及产物易于分离纯化等优点，研究生物酶法生产L-PPT的路线具有十分重要的产业价值和显著的社会效益。

L-PPT的生物合成一般分为两种策略，即动力学拆分和不对称合成，其中酰胺酶、脱乙酰酶、脱氢酶和转氨酶参与其中。由于能够产生纯净的异构体和100％的理论产率，不对称合成L-PPT在工业应用中更具竞争力。

转氨酶(TA)是一类依赖PLP的酶，能够催化氨基供体和氨基受体之间的氨基转移。根据转移氨基的位置，转氨酶大致可分为α-TAs(催化α-碳上的氨基转移)和ω-TAs(反应中转移的氨基距离羧基较远)。Mehta等人根据序列和结构相似性将转氨酶分类，并将其分为6个亚组或类别，I类和II类包括L-天冬氨酸转氨酶和L-丙氨酸转氨酶、III类ω-转氨酶、IV类D-氨基酸转氨酶和支链转氨酶(BCAT)、V类L-丝氨酸转氨酶和VI类糖转氨酶。转氨酶催化反应一般是经过两步实现。首先转氨酶通过转氨作用将氨基供体上的氨基转移到辅酶PLP的羰基上，形成5-磷酸吡哆胺(PMP)和与氨基供体对应的酮；然后PMP上的氨基在同一转氨酶的催化作用下转移到氨基受体上，实现产物胺化合物的生成，而PMP又转变为PLP。转氨酶主要用于手性胺、手性氨基酸、手性氨基醇等的合成，这些手性化合物常作为药品的活性成分或主要中间体被使用，例如，广谱触杀型除草剂草铵膦、治疗糖尿病药物的西他列汀及抗生素青霉素等，在制药工业、农业、化工业都有重要的作用。