[发明专利]一种转氨酶突变体及其工程菌与应用

权利要求书

1.一种来源于沙门氏菌(Salmonella enterica)的转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种含有权利要求1所述转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌。

3.一种权利要求1所述转氨酶突变体在微生物催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸不对称合成L-草铵膦中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为：以含所述转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后经镍柱纯化得到的纯酶液作为催化剂，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以L-谷氨酸为氨基供体，于pH6.0～10.0缓冲液中构成转化体系，在25～75℃、400～600r/min条件下反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到L-草铵膦。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述转化体系中，底物初始浓度为20～500mM，湿菌体用量为10～100g/L，纯酶用量为0.02～6U/mL，辅酶用量为0.1mM～1M，L-谷氨酸用量为20mM～1M。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含有转氨酶突变体基因的重组基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养9h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养至菌体OD₆₀₀达到0.4～0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；所述LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值7.0。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纯酶液的制备方法为：(1)将含转氨酶突变体基因的重组基因工程菌诱导表达得到的湿菌体用pH8.5、20mM磷酸盐缓冲液悬浮后，在40W条件下超声破碎10min，将破碎混合液在4℃、8000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液；超声破碎条件：功率为40W，破碎1s，暂停3s；(2)将步骤(1)上清液用Ni亲和柱进行纯化：先用平衡缓冲液冲洗Ni柱，流速为1mL/min，冲洗5-7个柱体积直到UV基线平衡；将步骤(1)上清液进行上样，流速为1mL/min，上样量为1～2个柱体积，使目的蛋白和Ni柱充分结合；接着用冲洗缓冲液冲洗杂蛋白，流速为1mL/min，洗脱3-5个柱体积，将杂蛋白冲洗干净，直到UV基线平衡；最后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，流速为1mL/min，当吸光度达到0.25并上升时开始收集，当吸光度降到0.25时，停止收集；将收集的洗脱液放入透析袋，以PBS缓冲液为透析液，在4℃温度下透析脱盐，取截留液，获得所述的纯酶液；平衡缓冲液：300mM氯化钠、20mM磷酸盐缓冲液，pH8.5；冲洗缓冲液：300mM氯化钠、50mM咪唑、20mM磷酸盐缓冲液，pH8.5；洗脱缓冲液：300mM氯化钠、500mM咪唑、50mM磷酸盐缓冲液，pH8.5。