[发明专利]固定化酶、其制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种固定化酶、其制备方法及应用。该固定化酶包括环氧树脂载体和酶，酶与环氧树脂载体通过共价键连接，环氧树脂载体为LX‑109S环氧树脂。本申请采用LX‑109S环氧树脂作为环氧树脂载体，基于该载体本身的特性，使得其对酶的固定化效果更为稳定，且与酶的共价键结合牢固，不会影响酶自身活性。

技术领域

本发明涉及酶的固定化技术领域，具体而言，涉及一种固定化酶、其制备方法及应用。

背景技术

生物催化已成为绿色合成药物的重要部分，也是催化药物结构单元和中间体最有前途的技术之一，尤其是为手性合成提供了独特的替代方法。 越来越多的生物酶在工业过程中被用作催化剂，但是由于酶使用条件的温和性和其本身的易变性使酶对环境要求非常的苛刻，且难回收利用，从而大大限制了酶在工业中的应用，导致固定化酶的需求增加，因此经常被称为“生物催化剂”的固定化酶被广泛用于工业有机合成和生物转化。

固定化酶的制作方法一般有吸附、共价偶联、交联法和包埋。共价偶联法是将酶的非活性侧链基团与载体中的活性官能团进行共价键和，如羧酸类、氨基类、环氧基类。其中环氧基类具有很高的反应活性和可塑性，载体上的环氧基团可以直接同酶分子上的-NH₂、-HS等非活性基团反应进行共价固定。由于环氧基的反应活性极高，对于含有多种非活性基团的酶，可进行多点固定来提高酶同在载体间的结合强度，因此环氧基类载体对酶的固定具有极高的优越性。

近年来合成化学家对连续流合成的兴趣日益浓厚，现在连续流合成也引起了生物转化的注意。新型固定化平台的出现使固定化酶在连续流生物催化中实现无缝整合。新型高效酶的发现和进化，以生物催化为重点的新型逆向合成方法，重组蛋白的成本降低和酶固定化策略都为连续流式生物催化做好了充分的准备。

环氧基树脂在酶的固定化中已被广泛应用，但是该树脂在固定化过程中对已纯化的纯酶的固定化效果较好，对粗酶液固定化效果不太理想，因此增加了固定化酶的成本。而且共价键合过程所发生的剧烈化学反应往往对生物分子的活性是极其不利的，所以对于活性中心较活泼的酶在固定化过程中会影响酶的活性，造成活性回收率极低。另外，环氧载体和酶的共价结合需要在高离子强度下进行，若离子强度不适合或环境中干扰因素较多，往往导致酶和载体之间仅以离子吸附的形式结合，并不能形成稳定的化学键结合可重复使用性差。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种固定化酶、其制备方法及应用，以解决现有技术中的环氧树脂固定化酶的固定化效果不稳定的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种固定化酶，该固定化酶包括环氧树脂载体和酶，酶与环氧树脂载体通过共价键连接，环氧树脂载体为LX-109S环氧树脂，酶来自于粗酶。

进一步地，上述酶选自转氨酶、D-乳酸脱氢酶、环己酮单加氧酶、酮还原酶、烯还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、脂肪酶及它们的突变体中的任意一种，优选氨裂解酶选自苯丙氨酸氨裂解酶中的任意一种，优选氨基酸脱氢酶选自亮氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶中的任意一种。

进一步地，上述固定化酶中，每克环氧树脂载体上酶的负载量为30 mg ~70 mg。

进一步地，上述固定化酶还包括辅因子。

根据本发明的另一方面，提供了一种上述任一种固定化酶的制备方法，该制备方法包括：步骤S1，将第一磷酸盐缓冲液与酶混合形成缓冲酶液；酶来为粗酶；步骤S2，将缓冲酶液与环氧基树脂混合进行固定化反应后用第二磷酸盐缓冲液洗涤，得到固定化酶，环氧树脂为LX-109S环氧树脂。

进一步地，上述缓冲酶液与环氧基树脂的体积比为3:1~5:1。

进一步地，上述第一磷酸盐缓冲液的pH值为7.0~8.0，第一磷酸盐缓冲液中含有氯化钠，优选第一磷酸盐缓冲液中所述氯化钠的浓度为1±0.2 mol/L；第二磷酸盐缓冲液的pH值为7.0~8.0，第二磷酸盐缓冲液中不含氯化钠。