[发明专利]用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物、核酸检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物，其特征在于：包括用于检测犬片状边虫的上游引物、用于检测犬片状边虫的下游引物、用于检测犬片状边虫的荧光探针、用于检测犬巴贝斯虫的上游引物、用于检测犬巴贝斯虫的下游引物、用于检测犬巴贝斯虫的荧光探针、外参照的上游引物、外参照的下游引物、外参照的荧光探针；所述用于检测犬片状边虫的上游引物：序列如SEQ ID NO: 1所示；所述用于检测犬片状边虫的下游引物：序列如SEQ ID NO: 2所示；所述用于检测犬片状边虫的荧光探针：序列如SEQ ID NO: 3所示，所述用于检测犬巴贝斯虫的上游引物：序列如SEQ ID NO: 4所示；所述用于检测犬巴贝斯虫的下游引物：序列如SEQ ID NO: 5所示；所述用于检测犬巴贝斯虫的荧光探针：序列如SEQ ID NO: 6所示；所述外参照的上游引物：序列如SEQ ID NO: 7所示，所述外参照的下游引物：序列如SEQ ID NO: 8所示；所述外参照的荧光探针：序列如SEQ ID NO: 9所示。

2.根据权利要求1所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物，其特征在于：所述用于检测犬片状边虫的荧光探针：5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团；所述用于检测犬巴贝斯虫的荧光探针： 5’端标记CY5荧光基团，3’端标记BHQ2淬灭基团；所述外参照的荧光探针： 5’端标记VIC荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团。

3.用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液、酶混合液、阴性对照品以及阳性对照品；所述PCR反应液包括PCR反应Buffer、具有如SEQ IDNO: 1-SEQ ID NO: 9所示序列的引物和探针。

4.根据权利要求3所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品：TE buffer。

5.根据权利要求3所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品：含犬片状边虫人工合成质粒、巴贝斯虫人工合成质粒和外参照人工合成质粒，浓度均为1×10⁶拷贝/mL。

6.用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括设计引物探针、构建反应体系以及建立反应程序；所述设计引物探针：针对片状边虫16Sribosomal RNA gene设计用于检测犬片状边虫的上下游引物和探针，序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3；针对巴贝斯虫small subunit ribosomal RNA gene设计用于检测巴贝斯虫的上下游引物和探针，序列如SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO:6；针对拟南芥SUC2基因设计外参照的上下游引物和探针，序列如SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO:9。

7.根据权利要求6所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述构建反应体系：PCR反应Buffer的终浓度为1×；用于检测犬片状边虫的引物SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2的终浓度均为0.2μM；用于检测巴贝斯虫的引物SEQID NO: 4和SEQ ID NO:5的终浓度均为0.2μM；用于检测犬片状边虫的探针SEQ ID NO: 3、用于检测巴贝斯虫的探针SEQ ID NO: 6以及外参照的引物探针SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO:9的终浓度均为0.2 μM；酶混合液在反应体系中的终浓度为1×。

8.根据权利要求6所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述建立反应程序：第一步：温度50℃，时间2 min；第二步：温度95℃，时间10min；第三步：温度94℃，时间15s，第四步：温度60℃，时间40s，其中第三步与第四步循环40次，在第四步时采集荧光信号。