[发明专利]一种星型胶质细胞特异性METTL3过表达的重组腺相关病毒的应用

说明书

本发明涉及一种星型胶质细胞特异性METTL3过表达的重组腺相关病毒在制备防治脊髓损伤的药物中的应用。本发明成功构建一种星形胶质细胞特异性METTL3过表达的重组腺相关病毒，该病毒可在体内星形胶质细胞中特异性过表达METTL3蛋白并靶向修饰下游YAP1mRNA的m⁶A水平，延长半衰期、维持其mRNA的稳定性并上调YAP1蛋白表达水平，促进反应型星形胶质细胞活化，改善脊髓损伤功能，为脊髓损伤的临床治疗提供了新的途径。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种星型胶质细胞特异性METTL3过表达的重组腺相关病毒及其在制备脊髓损伤治疗药物中的应用。

背景技术

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是由创伤、肿瘤或炎症等因素导致的脊髓完整性和连续性受到破坏，从而引起机体运动、感觉及自主功能障碍的中枢神经系统疾病。随着交通运输业的不断发展，脊髓损伤的发病率急剧增长，且脊髓损伤患者也呈年轻化趋势。脊髓损伤发生之后，脊髓生理结构第一时间被破坏并进一步影响神经功能，此过程称为原发性脊髓损伤。而继发性脊髓损伤是指在原发性损伤基础上水肿、缺血、炎症等导致的脊髓组织间接损伤，此阶段会引起更多的神经细胞死亡和轴突脱髓鞘改变，与神经功能恢复密切相关，因此，如何防止继发性脊髓损伤成为治疗的关键，然而，目前我们对脊髓损伤的治疗仍然束手无策。

脊髓损伤后，损伤灶周围的星形胶质细胞经历了一种特殊的变化，被成为反应型星形胶质细胞活化，其特征是星形胶质细胞的肥大、突触延伸以及增殖能力变强，同时伴有基因水平的改变。反应型星形胶质细胞活化的程度取决于损伤的严重程度以及距离损伤灶中心的距离。反应型星形胶质细胞可以在损伤灶周围形成致密的保护带，将损伤灶内的炎症环境与周围正常的神经组织隔离开，保护未受损的神经元，防止其进一步死亡。除了隔离损伤灶之外，反应型星形胶质细胞还能促进血脊髓屏障的修复、分泌神经营养因子、抑制氧化应激损伤等。既往研究表明，利用药物或基因修饰减少星形胶质细胞数量或抑制反应型星形胶质细胞活化会导致脊髓损伤后炎症细胞的扩散、神经元凋亡加重和损伤灶面积扩大，进一步阻碍功能恢复。因此，靶向调控脊髓损伤后反应型星形胶质细胞活化可能是促进脊髓损伤功能恢复的一种行之有效治疗方法。

RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60％以上，而N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m⁶A)修饰是mRNA上最为普遍的转录后水平修饰，调控着细胞的多种生物学功能，包括mRNA的成熟、转运、降解等。m6A修饰是一个可逆的过程，通常由三类特殊的蛋白完成，包括“writer、“eraser”和“reader”。“writer”即甲基转移酶，可特异性识别靶mRNA上的“GGAC”序列，并招募甲基腺苷修饰靶mRNA，而“eraser”可将m⁶A从mRNA上移除，完成去甲基化修饰，最后，经过m⁶A修饰的mRNA被“reader”蛋白识别，从而调控其定位或稳定性等功能。然而，m6A修饰在脊髓损伤后的作用尚不清楚。我们前期通过实验研究表明，作为m⁶A甲基转移酶复合体核心METTL3在脊髓损伤后表达显著升高，且定位于反应型星形胶质细胞中。体外敲低原代星形胶质细胞METTL3水平可显著抑制星形胶质细胞的增殖以及划痕愈合的速度，并且缩短星型胶质细胞突触的长度。既往研究表明，METTL3可以结合YAP1的mRNA，促进其m⁶A修饰并调控其稳定性，从而影响肿瘤进展。有趣的是，我们通过MeRIP-sequence联合mRNA-sequence测序表明，敲低原代星形胶质细胞METTL3也可以降低YAP1 mRNA 3’端非翻译区的m⁶A丰度，缩短YAP1 mRNA半衰期，降低其表达。