[发明专利]一种多重荧光pcr检测EGFR基因突变的引物和探针组合物、试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种多重荧光PCR检测EGFR基因突变的引物和探针组合物、试剂盒和检测方法，所述引物和探针组合物包括EGFR基因突变检测特异性引物对、EGFR基因特异性探针、扩增阻断探针和内控系统，其序列如SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 44所示。本发明在3个反应管内可同时检测EGFR基因32种突变，检测灵敏度为1％，操作简单，节约成本，样本量要求低，临床应用范围广。本发明可检测新鲜组织样本，FFPE样本及胸腹水样本。

技术领域

本发明属于EGFR基因突变检测技术领域，具体涉及一种多重荧光pcr检测EGFR基因突变的引物和探针组合物、试剂盒和检测方法。

背景技术

肺癌是目前世界上第一大癌，肺癌的发生率和死亡率在所有肿瘤中都占首位。在肺癌患者中，非小细胞肺癌(NSCLC)约占80-85％，目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌(NSCLC)临床治疗的重要手段。EGFR是一种跨膜受体络氨酸激酶，该区域的激活即磷酸化对癌细胞增殖、生长的相关信号传递具有重要意义，因此，EGFR作为NSCLC的分子靶标受到普遍关注，并陆续开发出了吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)和埃克替尼(icotinib)等EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，多项临床试验已证实，EGFR基因突变的晚期NSCLC患者能从EGFR-TKIs显著获益。EGFR基因突变多位于外显子18-21上。目前已经发现至少30种突变与EGFR-TKIs药物反应性有关，主要是19外显子的缺失突变和21外显子的L858R点突变，二者约占所有突变的80-90％，18外显子G719X约占突变的5％，20外显子插入突变约占1％。此外，大部分患者在服用EGFR-TKI一段时间后会出现耐药，其中约50％耐药患者可检测到EGFR 20外显子T790M突变。因此，检测EGFR基因突变对于指导NSCLC患者临床用药具有重要的参考价值。

ARMS-PCR(Amplification Refractory Mutation System)技术是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。基本原理：TaqDNA聚合酶缺少3-5外切酶活性，在一定条件下PCR引物3末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变和野生型基因的目的。ARMS-PCR方法灵敏度可达1％，可满足肿瘤组织样本的检测需求。

目前市面上的EGFR检测试剂盒多为单荧光突变检测，共7个孔，对样本量的要求比较高，成本也较大；厦门艾德生物医药科技股份有限公司的肺癌多基因检测试剂盒中EGFR突变检测采用3个荧光，共4个孔。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种多重荧光pcr检测EGFR基因突变的引物和探针组合物、试剂盒和检测方法。所述试剂盒采用4个荧光，3个孔即可实现对EGFR突变的检测。本发明可以解决微量样本的检测，提高检测合格率。同时方便了操作，提高了检测通量，降低了成本。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种多重荧光pcr检测EGFR基因突变的引物和探针组合物，所述组合物包括19del、S768I、L858R、EGFR 20ins、T790M、L861Q、G719X及内控的引物和探针，上述引物和探针分为组1、组2和组3，如下表1所示：

表1 EGFR基因突变引物和探针及分配方式

。

一种多重荧光pcr检测EGFR突变的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物和探针组合物。

优选的，所述试剂盒包含：

NEB universal probe qPCR master mix、上述引物和探针组合物、阳性对照和阴性对照。