[发明专利]一种多重荧光pcr检测EGFR基因突变的引物和探针组合物、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种多重荧光pcr检测EGFR基因突变的引物和探针组合物，其特征在于，所述组合物包括19del、S768I、L858R、EGFR 20ins、T790M、L861Q、G719X及内控的引物和探针，上述引物和探针分为组1、组2和组3，如下表所示：

。

2.一种多重荧光pcr检测EGFR突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合物。

3.根据权利要求2所述的多重荧光pcr检测EGFR突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

NEB universal probe qPCR master mix、权利要求1所述的引物和探针组合物、阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求3所述的多重荧光pcr检测EGFR突变的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括质粒DNA和野生型DNA混合物；所述阴性对照包括无核酸酶水。

5.权利要求1所述的引物和探针组合物，或权利要求2所述的试剂盒在基于多重荧光pcr检测EGFR突变中的应用。

6.一种多重荧光pcr检测EGFR突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)准备样品；

(2)构建多重荧光PCR扩增反应体系，包括分别由权利要求1所述的组1、组2和组3构成的三种反应体系，进行PCR反应；

(3)根据荧光PCR扩增仪显示的△ct值判定检测结果。

7.根据权利要求6所述的多重荧光pcr检测EGFR突变的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述样品包括组织样本，FFPE样本或胸腹水样本。

8.根据权利要求6所述的多重荧光pcr检测EGFR突变的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述三种反应体系包括：

19delL858R体系：权利要求1所述的组1、NEB universalprobeqPCR mastermix、样本；

L858REGFR 20ins体系：权利要求1所述的组2、NEB universalprobeqPCR mastermix、样本；

T790ML861QG719体系：权利要求1所述的组3、NEB universalprobeqPCR mastermix、样本。

9.根据权利要求6所述的多重荧光pcr检测EGFR突变的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR反应的条件如下：

第一阶段：95℃，1min，1个循环；

第二阶段：95℃，15s，64℃，30s，10个循环；

第三阶段：95℃，15s，60℃，30s，38个循环；

信号收集：第三阶段60℃时收集FAM/VIC/ROX/CY5信号，执行实时PCR，保存文件。

10.根据权利要求6所述的多重荧光pcr检测EGFR突变的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述根据△ct值判定检测结果的方法如下：

突变由FAM/ROX/CY5信号指示，内控由VIC信号指示，通过计算△ct值的大小进行判断，反应管的△ct值≤cutoff值时，则样本为该反应管对应信号突变阳性，反之则为阴性或低于试剂盒的检测下线；△ct值＝ct值突变位点-ct值内控。