[发明专利]一种DNA长度的熔解测定方法及试剂盒

说明书

本发明为一种DNA长度的熔解测定方法及试剂盒，其克服了现有技术中存在的当目标DNA的熔解温度相近时，无法依据熔解温度区分多个目标DNA的问题。本发明测定方法更加简单快速，可广泛用于基于核酸分析的食品真实性鉴定、医疗诊断等领域，具有较强的实际应用价值。本发明通过加入小分子季铵盐消除GC含量对熔解温度的影响，建立了荧光标记和非标记荧光熔解测定DNA长度的两种方法。利用加入以上3种添加剂后的熔解温度以及计算得到GC％两种方式测定未知DNA的长度。实现了DNA水解切割反应监测的应用，并将多重PCR和熔解测定长度方法结合检测了乳及乳制品中牛、山羊、绵羊三种动物源性成分。

技术领域：

本发明属于基于核酸分析的分析生物学检测技术领域，涉及一种DNA长度的熔解测定方法及试剂盒。

背景技术：

核酸分析是一种重要的食品检测手段，其中PCR技术因为具有高特异性、高灵敏度、高重复性以及检测结果可靠的优点，应用最为广泛。PCR(polymerase chain reaction，PCR)广泛应用于DNA的体外扩增，其扩增产物通常具有确定的长度，因此测定PCR产物长度能够鉴别PCR反应的特异性以及多重PCR反应的靶标来源。平板凝胶电泳和毛细管凝胶电泳是最常用的PCR产物长度测定方法，但通常需要转移溶液而且过程繁琐复杂。实时PCR技术主要通过聚合酶链式反应和荧光报告分子的结合来监测PCR扩增产物的产生。实时PCR主要分为探针法和染料法。荧光标记探针法，可以分为三种类型，一种是用于PCR扩增的引物探针，常见的有Scorpion，Amplifluor，LUX^TM等；另一种是与模板DNA结合的TaqMan水解探针、分子信标杂交探针；还有一种是核酸类似物。探针法特异性强，但通常需要标记报告基团和淬灭基团，合成及设计比较困难。LUX^TM引物探针只需标记一种荧光基团，其本身是一种发卡结构，当处于游离状态时，特异性序列可以猝灭荧光信号，当与DNA结合时发卡结构打开，荧光信号呈指数上升。但这种发卡引物需要专门的软件进行设计，过程比较复杂。为了降低引物设计难度，将荧光基团标记于线性引物上，并在引物的5′增加C碱基的数量，当DNA进行复制时，与C碱基互补配对的G碱基可以淬灭荧光信号，同样可以监测扩增产物的形成。实时PCR还可以采用染料结合法检测荧光信号，常见的DNA双链结合染料包括SYTO 9、SYBRGreen I、EvaGreen、ResoLight、LC Green等。

高分辨熔解曲线分析是一种高效，快速及可靠的PCR产物分析技术。熔解分析能够实现PCR产物的快速简便鉴别，但却无法获取长度信息，因为DNA熔解温度(Tm)数值不仅取决于长度，还有GC含量。本发明通过加入小分子季铵盐(四甲基氯化铵或四乙基氯化铵或甜菜碱)消除GC含量对熔解温度的影响，建立了荧光标记和非标记荧光熔解测定DNA长度的两种方法。

多重PCR可以降低检测成本，节约检测时间，实现同一样本的多组分同步检测，被应用于乳制品真实性鉴定。多重PCR与高分辨熔解技术结合，可以依据熔解温度区分多个目标DNA。但当目标DNA的熔解温度相近，则无法进行熔解区分，只能通过调节引物的大小和GC％来加以改善。为克服以上局限，当目标DNA的熔解温度相近，但PCR产物长度具有差异性时，通过加入添加剂来改变熔解温度，来实现区分不同目标DNA的目的。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种DNA长度的熔解测定方法及试剂盒，其克服了现有技术中存在的当目标DNA的熔解温度相近时，无法依据熔解温度区分多个目标DNA的问题。本发明测定方法更加简单快速，可广泛用于基于核酸分析的食品真实性鉴定、医疗诊断等领域，具有较强的实际应用价值。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种DNA长度的熔解测定方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)通过对DNA样品加入四甲基氯化铵或四乙基氯化铵或甜菜碱小分子季铵盐消除GC含量对熔解温度的影响；

2)建立不同添加剂对应的熔解温度和长度的标准曲线以及GC含量和加与不加添加剂的熔解温度差的标准曲线；