[发明专利]一种DNA长度的熔解测定方法及试剂盒

权利要求书

1.一种DNA长度的熔解测定方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)通过对DNA样品加入四甲基氯化铵或四乙基氯化铵或甜菜碱小分子季铵盐消除GC含量对熔解温度的影响；

2)建立不同添加剂对应的熔解温度和长度的标准曲线以及GC含量和加与不加添加剂的熔解温度差的标准曲线；

3)对于未知长度的DNA加入四甲基氯化铵或四乙基氯化铵或甜菜碱添加剂进行熔解，读取对应熔解温度带入两种标准曲线计算DNA长度；

4)对于DNA酶水解反应产物长度的测定，将四甲基氯化铵或四乙基氯化铵或甜菜碱添加剂加入DNA酶水解反应产物中，读取对应熔解温度带入两种标准曲线计算DNA水解产物长度；

5)对于PCR产物长度的测定通过设计对应PCR引物获得扩增子，将四甲基氯化铵或四乙基氯化铵或甜菜碱添加剂加入PCR产物中，读取对应熔解温度带入两种标准曲线计算PCR产物长度；

6)对于多重PCR产物区分及实际样品的检测，通过对比核苷酸序列及特异性检验，设计多对特异性PCR引物，对单重、双重及三重PCR扩增产物加入四甲基氯化铵或四乙基氯化铵或甜菜碱添加剂进行熔解区分。

2.根据权利要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法，其特征在于：步骤1)中，通过荧光标记和非标记荧光两种方式监测熔解曲线的形成，读取对应熔解温度。

3.根据权利要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法，其特征在于：步骤2)中，利用熔解温度或者GC含量任意一种方法计算DNA长度。

4.根据权利要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法，其特征在于：步骤3)中，通过加入四甲基氯化铵、四乙基氯化铵、甜菜碱添加剂中的任意一种进行熔解测定DNA长度。

5.根据权利要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法，其特征在于：步骤5)中，用于扩增山羊DNA的特异性引物对为Primer1、扩增牛DNA的特异性引物对为Primer2、扩增绵羊DNA的特异性引物对为Primer3；

所述引物对Primer1的序列为：

上游引物：5'-GGGGGGGGGGGCCATAATTACAACAA-3'

下游引物：5'-CCCTATCAGCTGCAGTAGGGTT-3'

引物对Primer2的序列为：

上游引物：5'-AGTAAGCGTAATTATGATAC-3'

下游引物：5'-CCCCCTTGATTCTCTTGGTGTAGAG-3'

引物对Primer3的序列为：

上游引物：5'-CGTAGATGTAGTATGACTTTTCCT-3'

下游引物：5'-GTGAAGTTAGTTAGGAGAGTAATTATA-3'。

6.根据权利要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法，其特征在于：步骤1)、步骤3)、步骤4)、步骤5)中，荧光标记的熔解体系为：1μL合成DNA或PCR扩增产物，6mM Mg²⁺，10mMHEPES及1～3M四乙基氯化铵或4～6M甜菜碱或2～4M四甲基氯化铵，无添加剂组用超纯水代替；非标记荧光标记熔解体系为：1μL合成DNA或PCR扩增产物，6mM Mg²⁺，10mM HEPES(pH7.9)，0.5×或2×DNA结合染料及1～3M四乙基氯化铵或4～6M甜菜碱或2～4M四甲基氯化铵，无添加剂组用超纯水代替；高分辨熔解程序为37～99℃，熔解速率为0.05℃/s。

7.根据权利要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法，其特征在于：步骤4)中，PCR反应体系组成为：50nM的正向引物和反向引物，1×Taq PCR Master Mix，2ng/μL的PCR纯化产物，最后用双蒸水补足10μL反应体系，并用双蒸水作为阴性对照,；PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性15s，57℃退火20s，72℃延伸30s，25个循环；72℃延伸5min。