[发明专利]一种合成熊果酸的重组酵母及其构建方法

说明书

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种合成熊果酸的重组酵母及其构建方法和应用，所述的重组酵母表达枇杷来源的CYP450酶，且可以高效合成熊果酸。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种高效合成熊果酸的酿酒酵母及其构建方法和应用。

背景技术

熊果酸（UA）是一种天然的五环三萜类羧酸，存在于多种水果和植物中，如苹果、山楂、女贞子等。有研究表明熊果酸具有很多重要的药理功能和生理活性，例如通过介导某些药理过程、调节部分信号通路，熊果酸可以用于预防一些慢性疾病的发展，同时具有抗氧化，抗炎，抗癌和保肝作用，并具有诱导细胞凋亡的能力。但是，目前熊果酸在工业上的主要来源仍然是从植物中提取，这其中必定会受到土地、气候等客观因素的制约，同时会产生占用耕地、消耗有机试剂等问题，严重制约了熊果酸的大规模推广和应用。而随着合成生物学和代谢工程等学科的发展，利用微生物细胞工厂来生产三萜类化合物成为当下热点。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其具有遗传背景清晰、基因操作技术成熟、安全无毒等优势而被选为底盘宿主。例如：专利CN111205993A公开了一种生产熊果酸和齐墩果酸的重组酵母菌及其构建方法和应用，公开了分别使用CYP716A12、CYP716AL1和AtCPR1提高熊果酸和齐墩果酸的产量。

发明内容

本申请进一步通过关键酶挖掘与异源表达，构建熊果酸合成途径；通过提高乙酰辅酶A等前体的供应，强化酵母合成熊果酸的能力；进一步通过分析合成途径与内源代谢网络的辅因子关系，改造熊果酸合成途径的辅因子供给，提高熊果酸合成效率；最后通过发酵优化，探索出最适pH和最佳营养成分。以酿酒酵母高产熊果酸为目标，从辅因子和前体供应的角度解决熊果酸在酵母中合成效率低的问题，也为其他三萜化合物的高效合成提供新的思路和方法。

本发明的目的是提供一种高效合成熊果酸的酿酒酵母及其构建方法。发明人创造性的发现细胞色素P450酶Ej8656，转化进合成α-香树脂醇（α-amyrin）的酿酒酵母，可以提高其合成熊果酸的产量。为了加强前体乙酰辅酶A的供应，过表达乙醛脱氢酶ALD6并敲除线粒体转运蛋白MPC2得到酿酒酵母菌株WN29；分析合成途径与内源辅因子代谢网络间关系，过表达来自乳酸克鲁维酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶GaPC和硅酸杆菌的NADH-rHMGR得到WN85。

本发明的第一方面，提供了一种合成熊果酸的重组酵母。

优选的，所述的重组酵母表达CYP450酶。所述的CYP450酶来源于枇杷。

优选的，所述的重组酵母还表达CPR酶。所述的CPR酶包括但不限于来源于苜蓿（优选蒺藜苜蓿）、甘草和/或百脉根。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组酵母表达CYP450酶和/或CPR酶。

优选的，所述的重组酵母过表达乙酰辅酶A前体合成途径的基因，过表达辅因子供给基因，和/或，降低乙酰辅酶A前体消耗途径的基因的表达。

所述的乙酰辅酶A前体合成途径的基因选自乙酰辅酶A合酶（优选为ACS1/ACS2）、乙醇脱氢酶（优选为ADH2）和/或乙醛脱氢酶（优选为ALD6）的编码基因；

所述的辅因子供给基因选自异柠檬酸脱氢酶（优选来源于酿酒酵母的IDP2）、苹果酸脱氢酶（优选来源于酿酒酵母的MAE1）、乙醛脱氢酶（优选为水稻基腐病菌（Dickeyazeae）的ADA、大肠杆菌（Escherichia coli）的eutE）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（优选为乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）的GaPC）和/或NADH依赖性的羟甲基戊二酸还原酶（优选来源于硅酸杆菌（Silicibaterpomeroyi）的rHMGR）的编码基因；