[发明专利]一种黄鳝生殖细胞异种移植及移植后嵌合性腺的检测方法

说明书

本发明属于水产动物遗传育种技术领域，公开了一种黄鳝生殖细胞异种移植及移植后嵌合性腺的检测方法。本发明建立了黄鳝原始生殖细胞活体荧光标记、流式细胞仪分选荧光细胞、生殖细胞缺失受体鱼制备以及幼鱼期黄鳝生殖细胞移植的技术方法，并根据黄鳝生殖细胞特异表达的dazl基因的3’‑UTR区域设计PCR引物，通过两轮PCR可在黄鳝生殖细胞极少的条件下扩增出目的片段，高灵敏度地鉴定出受体鱼性腺中是否存在定植的黄鳝生殖细胞。本发明提供的方法简单高效，灵敏度高，可有效应用于利用“借腹生殖”技术生产黄鳝配子的早期检测，在黄鳝“借腹生殖”技术的开发及解决黄鳝苗种短缺的产业问题方面有重要的应用前景。

技术领域

本发明属于水产动物遗传育种技术领域，更具体涉及一种黄鳝生殖细胞异种移植及移植后嵌合性腺的检测方法。采用本方法可对黄鳝生殖细胞异种移植后的定植成功率进行检测。适用于黄鳝“借腹生殖”技术的开发，以及异种生产黄鳝成熟配子的早期检测。

背景技术

鱼类生殖细胞移植技术是指将从供体鱼得到的生殖细胞植入受体鱼,获得生殖系嵌合体鱼并产生源自供体的配子或后代,也可称为鱼类“借腹生殖”技术。2003年，日本研究人员将虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的原始生殖细胞(primordial germ cell,PGC)成功移植到樱鳟(Oncorhynchus masou)体内(Takeuchi et al.,2003),首次实现鱼类的“借腹生殖”。2006年，将分离纯化的虹鳟A型精原干细胞(A-SG)移植到同种异体的受体鱼中，获得来源于供体鱼的功能性雌雄配子(Okutsu et al.,2006)，标志着生殖细胞移植技术获得重要突破。目前该项技术已在多种淡海水鱼类中获得成功，通过移植鲤鱼生殖干细胞至金鱼(Franek et al.,2021)、泥鳅生殖干细胞至斑马鱼(Saito et al.,2008)、稀有鮈鲫生殖干细胞至斑马鱼(Zhang et al.,2021)、大菱鲆生殖干细胞至牙鲆(Zhou et al.,2021)，获得供体鱼来源的鲤鱼、泥鳅、稀有鮈鲫及大菱鲆成熟配子。

黄鳝(Monopterus albus)是我国水产养殖重要的名特优对象。黄鳝雌雄同体、先雌后雄的性反转特性，导致雌性亲鳝通常因个体小而怀卵量少，雄性成熟亲鳝较少，而且人工繁殖时，需解剖雄性亲鳝获得性腺后才能得到配子，导致人工繁殖黄鳝不仅难度大，而且成本很高，养殖苗种主要依靠野生捕捞，但仅依靠野生捕捞难以满足黄鳝产业对于苗种的需求，因此苗种短缺一直是制约其养殖产业发展的瓶颈。将黄鳝生殖细胞移植到怀卵量大、性成熟周期短的受体鱼中，建立成熟的黄鳝生殖细胞移植技术流程，实现黄鳝“借腹生殖”，有望生产出大量的黄鳝卵或精子，进而解决黄鳝产业发展的苗种短缺瓶颈。

就鱼类生殖细胞移植的技术而言，首先，需要建立供体鱼的生殖干细胞有效分离技术，且分离操作需要保持生殖干细胞的活性，以获得可用于移植的供体细胞。其次，需要制备生殖细胞缺失或三倍体不育鱼作为移植受体；最后，需要建立高效的移植后的嵌合性腺检测方法。

供体与受体鱼亲缘关系的远近决定生殖细胞移植的成功与否。目前鱼类生殖细胞移植技术在不同科间、属间、种间或种内获得成功，但尚未见不同目间鱼类生殖细胞移植的成功案例。在分类上，黄鳝属于合鳃目、合鳃科，黄鳝属，合鳃目中鱼的种类较少，且这些鱼类不符合作为移植受体鱼应具有的怀卵量大或性成熟周期短的特征。

因此开展黄鳝生殖细胞移植研究需要解决不同目间生殖细胞移植的难题。此外，进行黄鳝生殖细胞移植研究需要分离获得具有活性的黄鳝生殖干细胞，如何对黄鳝原始生殖细胞进行活体标记并分离纯化获得具有活性的黄鳝原始生殖细胞是需要解决的另一难题。酶消化对细胞会造成损伤，针对不同的物种用到的酶和酶浓度是不一样的，同一物种不同研究论文中报道也有不同的情况(Goto et al.,2010；Zhang et al.,2020)，未见黄鳝消化液的报道，如何保证细胞活性的前提下，对胚胎期荧光标记的黄鳝原始生殖细胞细胞进行分离纯化以获得高纯度原始生殖细胞，这是本发明的难点。