[发明专利]一种黄鳝生殖细胞异种移植及移植后嵌合性腺的检测方法

权利要求书

1.一种黄鳝生殖细胞异种移植及移植后嵌合性腺的检测方法，包括下述步骤：

1)注射可阻断鲤鱼或斑马鱼dnd mRNA翻译的morpholino 至鲤鱼或斑马鱼受精卵，将生殖细胞剔除的鲤鱼或斑马鱼幼鱼作为黄鳝生殖移植的受体鱼；

2)注射活体荧光标记至1细胞期黄鳝胚胎，挑选带有荧光标记的黄鳝胚胎；选取卵黄后方的胚胎组织，利用含有0.05~0.3%胶原蛋白酶V和0.5-2%柠檬酸钠的Ringer平衡盐溶液对剪去的黄鳝胚胎组织消化，每间隔10~30分钟用5ml、10ml或20ml无菌注射器轻轻吹打2~10次，酶消化总时间不超过2小时，利用孔径70μm或100μm细胞筛滤去未解离的组织块，2000rpm离心3~8分钟，用含有胎牛血清的PBS溶液重悬细胞后用40μm或70μm细胞筛再次过滤后保留滤液，并在显微镜下观察确认滤液是否为外观完整的单细胞悬液；利用流式细胞仪对符合要求的单细胞悬液进行荧光分选，获得的GFP阳性细胞即为黄鳝原始生殖细胞，将黄鳝原始生殖细胞通过玻璃针注射到到内源生殖细胞剔除的鲤鱼或斑马鱼幼鱼性腺原基处，获得嵌合黄鳝生殖细胞的受体鱼；

3)提取黄鳝生殖细胞移植后1~12月龄的受体鲤鱼或斑马鱼性腺总RNA，逆转录为cDNA；

4)以步骤3）得到的cDNA为模板，通过巢式PCR扩增黄鳝生殖细胞特异表达的dazl基因序列； PCR巢式PCR第一轮的引物为eel-dazl-F1： 5’-AGTATGCCCTCCTTTCTCCT-3’, eel-dazl-R1： 5’-AATTGATGCCTTGATTGTCC-3’；第二轮PCR以第一轮PCR反应的产物为模板，引物序列：eel-dazl-F2： 5’-CAGAGCACCCTCACCATACC-3’, eel-dazl-R2 ：5’-GAATAGCCGAAAGCCCTTAT -3’；

第一轮PCR后扩增得到的黄鳝dazl片段为744bp,第二轮PCR后扩增得到的黄鳝dazl片段为355bp；表明受体鱼性腺中存在整合的黄鳝生殖细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的鲤鱼morpholino为：5’-cctgctgtagctgctgtccctccat-3’；

斑马鱼的morpholino为：5’-gctgggcatccatgtctccgaccat-3’。

3.根据权利要求1所述的方法，步骤2）中含有胎牛血清的PBS中，胎牛血清和PBS的体积比是2%。

4.权利要求1所述的方法在黄鳝商业养殖中的应用。