[发明专利]重组载体及其在构建糖尿病视网膜病变小鼠模型中的应用

说明书

本发明属于动物模型技术领域，具体涉及重组载体及其在构建糖尿病视网膜病变小鼠模型中的应用。所述重组载体是将SEQ ID NO.1第9‑492位所示DNA序列插入pAV‑CMV‑GFP‑miRNA载体的AsisI和MluI位点之间获得的。所述重组病毒是将包装质粒、辅助质粒和所述重组载体共转染至HEK‑293T细胞，培养72h后收集病毒获得的。对STZ诱导的小鼠进行高脂高糖饮食喂养建立糖尿病小鼠，通过玻璃体腔注射所述重组病毒促进其疾病进程，可形成糖尿病视网膜病变的小鼠模型，其自带荧光，易于观察视网膜病变，成模周期较短，动物成活率高，且寿命较长。

技术领域

本发明属于动物模型技术领域，具体涉及重组载体及其在构建糖尿病视网膜病变小鼠模型中的应用。

背景技术

近年来，糖尿病(DM)的发病率持续增加，严重影响人们的生活与健康。糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病微血管并发症，也是导致患者视力障碍或失明的重要原因。长期高血糖是DR患者发病的直接因素，最终导致患者微血管和视网膜损伤，甚至失明。根据病理变化，DR发展阶段包括非增殖性糖尿病视网膜病变(NPDR)和增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)。NPDR始于微血管病变，包括周细胞损失与内皮细胞损伤，血视网膜屏障的血管通透性增加，糖尿病性黄斑水肿、微动脉瘤、斑点状出血和棉绒斑。NPDR可进一步发展为PDR，且发病率随着病程的增加而增加。未治疗的PDR的并发症有玻璃体出血和牵拉性视网膜脱离。所以PDR是引起DR患者视网膜功能障碍的主要因素。

治疗DR主要取决于对糖尿病黄斑水肿和新生血管阶段的治疗。DR中抗血管内皮生长因子(VEGF)的发现是临床一个里程碑式的进展。目前，抗VEGF和糖皮质激素是DR并发症的主要治疗方法。然而，大部分的糖尿病黄斑水肿患者对这些单一疗法具有抗药性，而一小部分患者对双重疗法也具有抗药性，从而导致视力下降。因此，DR的治疗急需一种新疗法，最终逆转疾病进程。而动物模型为DR的研究和开发新一代眼科疗法提供了手段。

动物模型在DR的病理生理学、进展和病因学的研究中有至关重要的作用。啮齿动物成本低、寿命短、繁殖速度快，是DR动物模型中应用最广泛的。犬类DR的表型与人类DR非常相似，然而，伦理问题和成本效率阻碍其广泛应用。相比其他动物，大小鼠比较易于表现DR的发病机制。目前，有几种方法可诱导不同阶段的DR，包括药物诱导、基因编辑、环境暴露和外科手术等方法。在1型糖尿病(T1DM)中，DR的药理学诱导是通过四氧嘧啶或抗生素链脲佐菌素(STZ)给药破坏胰腺实现的。由于STZ显型速度更快，是诱导DR的首选药物。然而，STZ诱导的DR模型很少发生PDR。所以，目前还未有动物模型可完全模拟人DR的整个发病进程。

因此，急需开发一种新的DR高阶动物模型可模拟人类糖尿病视网膜病变。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的空白，提供重组载体及其在构建糖尿病视网膜病变小鼠模型中的应用。

第一方面，本发明提供一种重组载体，是将SEQ ID NO.1第9-492位所示DNA序列插入pAV-CMV-GFP-miRNA载体的AsisI和MluI位点之间获得的。

第二方面，本发明提供含有所述重组载体的重组病毒。

第三方面，本发明提供所述重组病毒的构建方法，是将包装质粒、辅助质粒和所述重组载体共转染至HEK-293T细胞，培养72h后收集病毒，得到所述重组病毒。

第四方面，本发明提供所述重组病毒在构建糖尿病视网膜病变小鼠模型中的应用。

第五方面，本发明提供一种构建糖尿病视网膜病变小鼠模型的方法，包括以下步骤：

给小鼠注射浓度为10mg/ml的STZ溶液，注射后持续高脂高糖高胆固醇喂食，然后玻璃体腔注射所述重组病毒，一个月后，再注射一次，得到所述糖尿病视网膜病变小鼠模型。

进一步的，所述小鼠为8周龄的雄性小鼠。