[发明专利]一种CK-MB重组蛋白的表达载体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种CK‑MB重组蛋白、其表达载体及制备方法和应用，属于基因工程技术领域。所述表达载体上包括CK‑M序列和CK‑B序列，还包括第一标签序列和第二标签序列，所述第一标签序列位于所述CK‑M序列之前或者之后，所述第二标签序列位于所述CK‑B序列之前或者之后。本发明的CK‑MB的表达载体表达出来的重组蛋白包含两种标签，可以使用两种不同的纯化方法，纯化方法简单，并且纯化后的重组蛋白没有多余的蛋白片段，纯度高，并且使得两种蛋白同时于原核细胞中低温诱导表达，并于原核细胞胞内组装，以天然二聚体形式大量表达于胞内上清表达出来，重组蛋白活性高。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种CK-MB重组蛋白的表达载体及其制备方法和应用。

背景技术

心肌酶谱系列是心血管疾病常用的检测指标，包括肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、氨酸转氨酶(AST)等。如果心肌细胞发生坏死或者破裂，这些酶就会被释放进入血液当中，使其在血液中的浓度升高。因此，心肌酶谱的升高程度可以作为间接衡量心肌细胞损害程度的重要指标，其中CK是灵敏度较高的指标。CK为二聚体酶，分子大小为81000～82000Da，由两个相同或者相似的亚基组成，包括脑型(BB)、肌肉型(MM)、杂化型(MB)、线粒体型(MiMi)4种同工酶，其中，CK－MB的特异性高。

目前，CK-MB检测通常采用免疫分析法，需使用大量高质量的标准品和抗体。由于人CK-MB天然来源有限，通过基因工程方法来制备高质量的重组CK-MB免疫原和标准品成为获得CK-MB的重要手段。CK－MB二聚体的每个亚基的N末端均有一个小结构域通过连接序列连接到C－末端的一个大结构域上。整个二聚体中，98％的酪氨酸残基被包裹在空间结构内部，仅有2％暴露在结构表面；另外，每个亚基表面均包含2个可以反应的组氨酸残基和2个可以反应的巯基。其复杂的空间结构给体外重组技术的应用带来了很大困难，因此重组难度高。

中国发明专利申请公开文本CN107698683A公开了一种CK MB融合蛋白及其制备方法，该融合蛋白由CK-M蛋白和CK-B蛋白通过Loop连接形成，与天然CK-MB蛋白功能相同。其制备方法是将人源性CK-M和CK-B的编码基因序列用Loop的核苷酸碱基偶联在一起，克隆到表达载体得到表达质粒，进而利用大肠杆菌表达，产物经纯化，得到活性蛋白含量为85％的融合蛋白。利用该方法制备的融合蛋白需要复杂的Loop连接过程，并且得到的活性蛋白纯度较低。

中国发明专利申请公开文本CN110904068A公开了CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法，首先分别克隆M亚基基因片段和B亚基基因片段，分别插入至表达载体；然后分别转化、诱导表达、分离纯化，得到M亚基蛋白和B亚基蛋白；再将M亚基蛋白和B亚基蛋白稀释后等比例混合，形成CK-MB型肌酸激酶同工酶二聚体蛋白。然而，利用该方法在体外进行组装，效率较低，且形成的CK-MM/BB杂蛋白无法去除。

然而现有技术的制备方法中，获得CK-MB的纯化方法复杂，样品纯度低，样品表达量低，活性低，难以满足市场上对CK-MB重组蛋白的需求。

发明内容

为了解决现有技术中CK-MB重组蛋白纯化方法复杂、样品纯度低等技术问题中的至少一个，本发明旨在提供一种CK-MB重组蛋白的表达载体及其制备方法，简化纯化步骤，获得纯度高的重组蛋白。为了达到该目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明的第一方面提供一种CK-MB重组蛋白的表达载体，所述表达载体上包括CK-M序列和CK-B序列，还包括第一标签序列和第二标签序列，所述第一标签序列位于所述CK-M序列之前或者之后，所述第二标签序列位于所述CK-B序列之前或者之后。

利用本发明的表达载体得到的CK-MB重组蛋白，CK-M携带第一标签，CK-B携带第二标签，如此可以使用针对两种标签的纯化方法分别进行纯化，经过两步纯化，能够去除未成功组装的CK-M/B蛋白，获得只含有CK-MB二聚体形式的活性重组蛋白，从而得到高纯度的CK-MB蛋白。