[发明专利]一种猪蓝耳类NADC30毒株的荧光探针引物、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及生物学分子技术领域，尤其是涉及一种猪蓝耳类NADC30毒株的荧光探针引物、试剂盒及其应用。本发明选择NADC30‑like、Jxa 1、GM2、XHGD基因组的保守序列之间同源性较低的序列设计探针引物，本发明试剂盒可以同时进行大批量的样本分析，一次检测即可鉴别样本中是否有类NADC30毒株，且本发明提供一种猪源型内参，能够满足检测猪源样品时内控核酸检测的要求，避免假阴性结果，具有简便快捷、稳定性好、灵敏度高、特异性强的特点。

技术领域

本发明涉及生物学分子技术领域，尤其是涉及一种猪蓝耳类NADC30毒株的荧光探针引物、试剂盒及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)感染引起的一种以怀孕母猪流产、早产和死胎等繁殖障碍和仔猪、育肥猪呼吸系统紊乱和生长迟缓为主要症状的高度接触性传染病，是严重危害养猪业的传染病之一。根据毒株间的基因组特性，PRRSV可以分为两个基因型，即以VR2332株为代表的美洲型和以LV株为代表的欧洲型，2012年起，一类具有非常独特的遗传背景，与2008年在美国分离到的美洲型NADC30毒株有很高的核苷酸相似度的PRRSV毒株在我国养猪场广泛发现，命名为PRRSV类NADC30株，已对我国养猪业造成一定的经济损失。

PRRSV是一种单链RNA病毒，其基因组总长度约为15Kb，基因组的5’端有一个类似于帽子的引导序列，3’端有一个Poly(A)尾序列。病毒基因组中从5’端至3’端有10个互相重叠的开放阅读框架构成。它们分别是ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF2a、ORF3～ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7等，ORFs1a和1b编码非结构蛋白(NSPs)；ORFs 2a、2b、3、4和5编码囊膜蛋白；ORFs 6和7分别编码基质蛋白和核蛋白。

nsp2基因长度约为2.9kb，在所有的非结构蛋白中最大，编码该蛋白的基因常常发生碱基缺失、突变和插入的变异现象，因此，不同病毒株的长度之间存在差异。nsp2抗原表位多，在表位集中区域容易发生基因缺失或突变，因此保守性最差，美洲株和欧洲株中氨基酸序列的同源性仅为32％。

NADC30 like毒株在致病性上比经典毒株弱，但是同样持续感染，且主要造成母猪流产，流产率较高，对猪场的经济效应影响较大，同时仔猪感染后，免疫力受到抑制，导致条件性致病菌发病，造成较严重呼吸症状和继发感染，临床症状较严重且存在较高的死亡率，目前公开的检测手段如冻干微芯片，制作工艺较为复杂，成本较高。现在生猪养殖处于非洲猪瘟防疫阶段和复产关键阶段，且据报道华南区大部分养殖场感染NADC30 like毒株，因此急需一种成本低且快速便捷的检测方法对NADC30 like毒株进行监测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种猪蓝耳类NADC30毒株的荧光探针引物、试剂盒及其应用。本发明选择NADC30-like、Jxa 1、GM2、XHGD基因组的保守序列之间同源性较低的序列设计探针引物，本发明试剂盒可以同时进行大批量的样本分析，一次检测即可鉴别样本中是否有类NADC30毒株，且本发明提供一种猪源型内参，能够满足检测猪源样品时内控核酸检测的要求，避免假阴性结果，具有简便快捷、稳定性好、灵敏度高、特异性强的特点。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一个目的是提供一种猪蓝耳类NADC30毒株的引物探针组，所述引物探针组包括：

上游引物NADC30-F：5’-TCCGGAGAACAGGCCTCTT-3’(序列如SEQ ID NO.1所示)；

下游引物NADC30-R：5’-ACCGCACCCGGACTTGATCT-3’(序列如SEQ ID NO.2所示)；