[发明专利]一种猪蓝耳类NADC30毒株的荧光探针引物、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种猪蓝耳类NADC30毒株的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括：

上游引物NADC30-F：5’-TCCGGAGAACAGGCCTCTT-3’；

下游引物NADC30-R：5’-ACCGCACCCGGACTTGATCT-3’；

荧光探针引物NADC30-P：5’-CTGCCCCACGCAAG-3’，其中5’端添加报告基团FAM，3’端添加淬灭基团MGB。

2.根据权利要求1所述的一种猪蓝耳类NADC30毒株的引物探针组，其特征在于，还包括猪源型内参的引物探针组，所述引物探针组包括：

上游引物actin-F：5’-TGACGGAGCGGGGCTACAG-3’；

下游引物actin-R：5’-ATCGTGCGGGACATCAAGGAGAAGC-3’；

荧光探针引物actin-P：5’-TCGTTGCCGATGGTGATGA-3’，其中5’端添加报告基团HEX，3’端添加淬灭基团BHQ1。

3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阴性对照、阳性对照、引物预混液、探针预混液、PCR扩增液、酶预混液；

所述引物预混液包括NADC30-F、NADC30-R、actin-F和actin-R，

NADC30-F：5’-TCCGGAGAACAGGCCTCTT-3’，

NADC30-R：5’-ACCGCACCCGGACTTGATCT-3’，

actin-F：5’-TGACGGAGCGGGGCTACAG-3’，

actin-R：5’-ATCGTGCGGGACATCAAGGAGAAGC-3’；

所述探针预混液包括NADC30-P和actin-P，

NADC30-P：5’-CTGCCCCACGCAAG-3’，其中5’端添加报告基团FAM，3’端添加淬灭基团MGB，

actin-P：5’-TCGTTGCCGATGGTGATGA-3’，其中5’端添加报告基团HEX，3’端添加淬灭基团BHQ1。

4.根据权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有类NADC30毒株和猪源内参基因β-actin基因片段的重组质粒；

所述阴性对照为双蒸水；

所述PCR扩增液为南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的2×One Step U⁺；

所述酶预混液为南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的One Step U⁺Enzyme Mix。

5.一种如权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用具体包括以下步骤：

(1)提取待测样品的总RNA；

(2)以步骤(1)中得到的总RNA为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为实验组；以阴性对照为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为阴性对照组；以阳性对照为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为阳性对照组；

(3)根据步骤(2)的荧光扩增反应结果判定待测样品为蓝耳类NADC30病毒和/或猪源性内参核酸阳性或阴性。

6.根据权利要求5所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，步骤(2)中，以荧光反应体系总体积为30μL计，实验组包括总RNA 6μL，引物预混液2.4μL，探针预混液0.6μL，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH₂O 4.5μL；

阴性对照组包括引物预混液2.4μL，探针预混液0.6μL，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH₂O 10.5μL；

阳性对照组包括含有类NADC30毒株和猪源内参基因β-actin基因片段的重组质粒6μL，引物预混液2.4μL，探针预混液0.6μL，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH₂O 4.5μL。