[发明专利]一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法

权利要求书

1.一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，其特征在于，包括样品的选择和样品的处理方法及流程，所述样品的选择模式一共分为四个模式，且四个模式分别为固液混合样、固液同时选择、只选固相样品和只选液相样品，所述样品的处理方法及流程分为采样时间的选择、样品的采集和样品的处理三个大步骤，且样品的处理又包括液相样品的处理和固相样品的处理。

2.根据权利要求1所述的一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，其特征在于，所述固液混合样的选择一般在进行常规的瘤胃微生物研究时，可以将处理后的固液相样品混合进行研究。

3.根据权利要求1所述的一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，其特征在于，所述固液同时选择，即同时选择固相和液相样品并分别进行测序研究，虽然成本高，数据量大，但能获得更准确全面的结果。

4.根据权利要求1所述的一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，其特征在于，所述只选固相样品在进行诸如纤维素、木质素降解，或者对某单一饲料原料的特定种群进行研究时，或通过文献资料明确目标物种存在于固相样品中时。

5.根据权利要求1所述的一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，其特征在于，所述只选液相样品在进行可溶性营养物质相关的研究，或通过文献明确目标物种存在于液相样品中时。

6.根据权利要求1所述的一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，其特征在于，所述采样时间的选择：采样时间对结果的影响该至关重要，有研究表明饲料进入瘤胃后五分钟，瘤胃微生物就开始附着于饲料表面，在采食后24小时之前固液相分离最明显，也是饲料消化的高峰期。随着消化时间的延长，饲料易消化的部分被微生物降解，最终附着于饲料上的微生物主要是一些难降解的纤维素或木质素利用物种。因此根据研究目的，合理选择样品采集时间非常重要。

7.根据权利要求1所述的一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，其特征在于，所述样品的采集：在选定好采样时间后，通过瘤胃瘘管、口鼻插管或屠宰等方式收集瘤胃内容物，注意取瘤胃不同部位的样品进行混合。然后在无菌条件下通过四层无菌棉布等方式进行过滤，将所得样品粗分为固液两部分，液氮冷冻然后-80℃保存或直接进行处理。

8.根据权利要求1所述的一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，其特征在于，所述样品的处理：将采集回的固液粗分样品进行微生物洗脱处理，若是冷冻样品需要在4°条件下解冻后处理，处理中生理盐水可用PBS代替。

9.根据权利要求1所述的一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，其特征在于，所述液相样品的处理：将过滤后的瘤胃液在室温下350g离心15min。取上清液，弃沉淀，以去除悬浮于滤液当中的植物饲料颗粒及其他杂质，然后将上清液在室温下10000g离心20min取沉淀，用少量灭菌生理盐水悬浮沉淀，作为瘤胃液相微生物，-80℃保存，直接进行接下来的DNA提取环节。

10.根据权利要求1所述的一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，其特征在于，所述固相样品处理：将粗分得到的固体样品用灭菌生理盐水轻轻冲洗几遍，以去除液相微生物的残留，缓慢挤掉多余水分，将50克的固体样本转移到离心管中，并加入150毫升灭菌生理盐水，以重悬植物颗粒，混合物震荡混匀30s，然后在室温下350g离心15min，沉淀植物颗粒，将上清液小心取出并转移到新管S中置于4℃或冰上，将回收的沉淀物重新悬浮在25ml含0.15％(v/v)吐温-80的灭菌生理盐水中，震荡混匀30s，并将该混合物置于冰上2.5h以洗脱紧密附着的细菌，将洗脱完的混合物体系震荡混匀30s，在室温下350g离心15min除去植物颗粒后，滤液与S瓶中的上清液混合并在4℃下10000g离心20min，沉淀部分即回收的固相微生物细胞，将沉淀重新悬浮在最小体积的灭菌生理盐水中，即为瘤胃固相微生物，并在-80℃下储存分析。