[发明专利]增强荧光强度的扩增引物、分子量内标及制备方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及增强荧光强度的扩增引物、分子量内标及制备方法。与现有技术相比，本发明通过荧光共振能量转移技术，将具有两种不同激发波长荧光基团标记的扩增引物与位于pUC57质粒上特定长度的核酸片段反应制得分布均匀的分子量内标，可以高效的将加入的扩增引物完全消耗，适用于毛细管电泳仪，荧光信号比普通的分子量内标高10倍以上，大大降低了分子量内标的使用成本。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及增强荧光强度的扩增引物、分子量内标 及制备方法。

背景技术

基因检测的一种重要手段是利用毛细管电泳对不同大小的基因片段进行分 离和鉴定。毛细管电泳是一种高效的生物大分子分离技术，结合荧光标记引物和 自动检测系统，可以高效的自动检测核酸等生物大分子片段，用来区分不同长度 或荧光标记的核酸。

在利用毛细管电泳进行核酸片段分析时，需要分子量内标来对核酸的长度进 行标定。毛细管电泳分离核酸的分辨率可小于1bp。而自动化的毛细管电泳是对 核酸的一端进行荧光基团标记，通过激光光源对标记的荧光基团进行激发发射出 特定波长的光并被CCD检测到。通过多通道(多种荧光基团的标记)的检测可 以提升检测的核酸种类，目前市场上常见的毛细管电泳仪采用的激发光源的激发 光为488nm，同时基本都为5～6个通道，其中分配给分子量内标的通道通常为 波长最长的通道，由于距离激发光488nm较远，分子量内标标记的荧光基团通 常荧光强度较低。而为了获得较好的荧光强度，需要提高分子量内标的使用量， 这就造成很多的负面影响，包括检测成本的上升、由于分子量内标使用量大造成 泳道拥堵而使内标峰变宽等缺点。

发明内容

针对以上述背景技术的不足，本发明提供增强荧光强度的扩增引物、分子量 内标及制备方法，解决了多通道检测存在荧光强度较低的问题。

一方面，本发明提供增强荧光强度的扩增引物，关键在于：包括正向引物 和反向引物；

所述正向引物序列为

GP-F：GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTC

所述反向引物序列为

GP-R:CCAAGATGACCAACAGAGCGAG；

所述GP-F引物的碱基上分别修饰受体荧光基团和供体荧光基团，供体荧光 基团的激发波长小于受体荧光基团的激发波长。

优选的，所述受体荧光基团和所述供体荧光基团均标记在所述GP-F引物5’ 端的碱基上，并且所述受体荧光基团和所述供体荧光基团相距至少一个碱基。

优选的，所述受体荧光基团修饰所述GP-F引物5’端的第2个T碱基，所述供 体荧光基团修饰所述GP-F引物5’端的第4个T碱基。

优选的，所述供体荧光基团为FAM、HEX、TET、VIC、CY3；所述受体荧 光基团为CY5。

另一方面，本发明提供一种增强荧光的分子量内标的制备方法，关键在于 包括以下步骤：

S1.分别以合成质粒作为模板、权利要求1-4所述的扩增引物、聚合酶、配 置成扩增体系，进行多重PCR扩增；

S2.检测各PCR扩增产物检测并混合；

S3将混合产物纯化，得到分子量内标。

优选的，所述合成质粒分别为：

L75：

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCAACAGCTATGACCTAACAACATGCCCTTTACACCACACTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L90：