[发明专利]增强荧光强度的扩增引物、分子量内标及制备方法

权利要求书

1.增强荧光强度的扩增引物，其特征在于：包括正向引物和反向引物；

所述正向引物序列为

GP-F：GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTC

所述反向引物序列为

GP-R:CCAAGATGACCAACAGAGCGAG；

所述GP-F引物的碱基上分别修饰受体荧光基团和供体荧光基团，供体荧光基团的激发波长小于受体荧光基团的激发波长。

2.根据权利要求1所述的增强荧光强度的扩增引物，其特征在于：所述受体荧光基团和所述供体荧光基团均标记在所述GP-F引物5’端的碱基上，并且所述受体荧光基团和所述供体荧光基团相距至少一个碱基。

3.根据权利要求2所述的增强荧光强度的扩增引物，其特征在于：所述受体荧光基团修饰所述GP-F引物5’端的第2个T碱基，所述供体荧光基团修饰所述GP-F引物5’端的第4个T碱基。

4.根据权利要求2所述的增强荧光强度的扩增引物，其特征在于：所述供体荧光基团为FAM、HEX、TET、VIC、CY3；所述受体荧光基团为CY5。

5.增强荧光的分子量内标的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

S1.分别以合成质粒作为模板、权利要求1-4所述的扩增引物、聚合酶配置成扩增体系，进行多重PCR扩增；

S2.检测各PCR扩增产物检测并混合；

S3将混合产物纯化，得到分子量内标。

6.根据权利要求5所述的增强荧光的分子量内标的制备方法，其特征在于所述合成质粒分别为：

L75：

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCAACAGCTATGACCTAACAACATGCCCTTTACACCACACTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L90：

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCAACAGCTATGACCTAACCAGAGCCAGAAGGAATCAACAACATGCCCTTTACACCACACTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L150：

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCAACAGCTATGACCTAATTCCCAGTTGAGTCTGTGGCTTCTCGGATCCCAGAGCCAGAAGGAATCAACAACATGCCCTTTACACCACACTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L180：

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCAACAGCTATGACCTCGGCTTGAAGATCGTCAGTCCTTTCGTAACAATTCCCAGTTGAGTCTGTGGCTTCTCGGATCCCAGAGCCAGAAGGAATCAACAACATGCCCTTTACACCACACTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L210-120：

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCAACAGCTATGACCTCGGCTTGAAGTTGCATCCGGATGTTAGAACTGAATGTGAGATCGTCAGTCCTTTCGTAACAATTCCCAGTTGAGTCTGTGGCTTCTCGGATCCCAGAGCCAGAAGGAATCAACAACATGCCCTTTACACCACACTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L235：

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCCGCCCAAGTATCCCTGTAAAACAAAAACCAAAAGAAAAGGATTTGGAGTTCCATGGAGTGATGAGATTTTATTTTCAAGATAAAGCTGCTGGAAACTTTGCAACAAAATGTATTCGGGTCTCTAGTACTGCCACCACTCAAGATGTAATCGAAACGCTCGCGGAGAAATTTCGACCTGATATGCGAACTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L265：

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCTGAACCTTTAATTAAAAAGTTGAAGAAACCCCCTACAGATGAAGAGTTAAAGGAAACAATAAAGAAATTACTGGCCAGTGCTAACTTGGAAGAAGTCACAATGAAACAGATTTGCAAAAAGGAAATTCGGCGCCTTCATCAGTATGTGAAATTTGCTGTCCAAGATGTGAATGATGTTCTAGACTTGGAGTGGGATCAGCATCTGGAACAAAAGAAACTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L305：

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCGAGTAGCTATGGTCAACAAAGCAGCTATGGGCAGCAGCCTCCCACTAGTTACCCACCCCAAACTGGATCCTACAGCCAAGCTCCAAGTCAATATAGCCAACAGAGCAGCAGCTACGGGCAGCAGATTGCCATTGCCCCAAATGGAGCCTTACAGTTGGCAAGTCCAGGCACAGATGGAGTACAGGGACTTCAGACATTAACCATGACAAATTCAGGCAGTACTCAGCAAGGTACAACTATTCTTCAGCTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L335：

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCACAGCTATGGACAGCAGAGTAGCTATGGTCAACAAAGCAGCTATGGGCAGCAGCCTCCCACTAGTTACCCACCCCAAACTGGATCCTACAGCCAAGCTCCAAGTCAATATAGCCAACAGAGCAGCAGCTACGGGCAGCAGAACCCTTCTTATGACTCAGTCAGAAGAGGAGCTTGGGGCAATAACATGAATTCTGGCCTCAACAAAAGTCCTCCCCTTGGAGGGGCACAAACGATCAGTAAGAATACAGAGCAACGGCCCCAGCCAGATCCGTATCACTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L365：

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCTTTGAACTTGCTCCCTCAGGCTACTCAGCAGCCTCAGGAAGGTTGTAGGGATTAGAGAGGGAGTGAAGTGAATGTTGCTGAGGTTTTCCAGCACTCTGACATATGGCCATTTCTGTTTTCCTGTAGCAAAACCAGAAATCCTGACTTACGGCAGGCTCGTGAATGGCATGCTCCAATGTGTGGCAGCAGGATTCCCAGAGCCCACAATAGATTGGTATTTTTGTCCAGGAACTGAGCAGAGGTGAGATGATTATTTTTGGCACTGCTTATAATGCAGAGGGGAAGGACTGCAATTCACTTGAATTTCAAATACTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L390：

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCTCTGTTTCTCCCTCTGCAGAGTTGTTAGCGGTTCTCAAGATGCCACTCTTAGGGTTTGGGATATTGAGACAGGCCAGTGTTTACATGTTTTGATGGGTCATGTTGCAGCAGTCCGCTGTGTTCAATATGATGGCAGGAGGGTTGTTAGTGGAGCATATGATTTTATGGTAAAGGTGTGGGATCCAGAGACTGAAACCTGTCTACACACGTTGCAGGGGCATACTAATAGAGTCTATTCATTACAGGTAAGATCTCTTATCTCTCCCTTAAATGCTCTCCTGATGAATCATAAGGTTGTTTTACTCAGATAATCACTGTCAAATTGCTGATCCAGTACAGTCCAAAAACTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L425

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCGCCAGAAGGAATCAACAACATGGAAAGAAATGGTTGAAGATTAATATTACCAACTCATGACTGTCCTTTCTTTGTTTACATTTTAGGCTGCTGGTCTGGCTACTATGATCTCTACCATGAGACCTGATATAGATAACATGGATGAGTATGTCCTTAACACAACAGCTAGAGCTTTTGCTGTTGTAGCCTCTGCCCTGGGCATTCCTTCTTTATTGCCCTTCTTAAAAGCTGTGTGCAAAAGCAAGAAGTCCTGGCAAGCGAGAGACACTGGTATTAAGATTGTACAACAGATAGCTATTCTTATGGGCTGTGCCATCTTGCCACATCTTAGAAGTTTAGTTGAAATCATTGAACATGGTAAGTTGTAATGTAACTTTCTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L460

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCGTAACAATTCCCAGTTGAGTCTGTGGCGATGGCAGTAGACTTGGCTTTCCCATTACTCTTTTCTCCAGGAAAACATGGCTGGCAAGGGCTTCTCCTTCTGGGTCTGGCTGGACAATATCATTGACCTTGTGAAAAAGTACATCCTGGCCCTTTGGAACGAAGGGTAGGTTGGACAGAGTGTGCACAGATGTAACCAAGTCCCCTGCTCTCAGCAAGCCAGTGGCAGGGGATGGATGCCCTGTTAGCAATAACAACATTGTTCCTCCTCCTTGGCTCCAGGTACATCATGGGCTTTATCAGTAAGGAGCGGGAGCGGGCCATCTTGAGCACTAAGCCTCCAGGCACCTTCCTGCTAAGATTCAGTGAAAGCCGCAAAGAAGGAGGCGTCACTTTCACTTGGGTGGAGACTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L490

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCCAGAGCCAGAAGGAATCTATGTGAACATCATTCAAGGCGTACTTTTGATTTTTATTTTTGGTGTACTGAATACTTTAAAACAAAAGTATTGGATTTTTTATAATATAAGCAACACTATAGTATTAAAAAGTTAGTTTTCACTCTTTACAAGTTAAAATGAATTTAAATGGTTTTCTTTTCTCCTCCAACCTAATAGTGTATTCACAGAGACTTGGCAGCCAGAAATATCCTCCTTACTCATGGTCGGATCACAAAGATTTGTGATTTTGGTCTAGCCAGAGACATCAAGAATGATTCTAAGTATGTGGTTAAAGGAAACGTGAGTACCCATTCTCTGCTTGACAGTCCTGCAAAGGATTTTTAGTTTCAACTTTCGATAAAAATTGTTTCCTGTGATTTTCATAATGTAAATCCTGTCTAGGGATATCACACATTTTCTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG；

L520

GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCCTTATCCTGCCTGGTATTGTCATCCTGTCCTGCTATTGCATTATCATCTCCAAGCTGTCACACTCCAAGGGCCACCAGAAGCGCAAGGCCCTCAAGACCACAGTCATCCTCATCCTGGCTTTCTTCGCCTGTTGGCTGCCTTACTACATTGGGATCAGCATCGACTCCTTCATCCTCCTGGAAATCATCAAGCAAGGGTGTGAGTTTGAGAACACTGTGCACAAGTGGATTTCCATCACCGAGGCCCTAGCTTTCTTCCACTGTTGTCTGAACCCCATCCTCTATGCTTTCCTTGGAGCCAAATTTAAAACCTCTGCCCAGCACGCACTCACCTCTGTGAGCAGAGGGTCCAGCCTCAAGATCCTCTCCAAAGGAAAGCGAGGTGGACATTGATCTGTTTCCACTGAGTCTGAGTCTTCAAGTTTTCACTCCAGCTAACACAGATGTAAAAGACTTTCTCGCTCTGTTGGTCATCTTGG。