[发明专利]一种基因敲除载体及其构建方法与用途

说明书

本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种基因敲除载体及其构建方法与用途。包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段能够特异性靶向编码斑马鱼PKR链接区的基因片段。该基因敲除载体能够精准敲除编码斑马鱼PKR链接区的基因片段，特别是能够精准敲除编码斑马鱼PKR链接区中包含碱性区在内的28个氨基酸的基因片段，使得斑马鱼体内能够表达有链接区碱性区缺失的PKR异构体，其单链RNA结合能力降低，特别是与5’端三磷酸的mRNA的结合能力降低，PKR被单链RNA活化降低，从而降低PKR抑制蛋白翻译的功能，有效促进蛋白质翻译过程，从而增强斑马鱼的抗病毒免疫相关蛋白的翻译，增强斑马鱼的抗病毒免疫功能。

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种基因敲除载体及其构建方法与用途。

背景技术

CRISPR/Cas9是基于II型CRISPR系统开发而来的，主要由RNA导向的Cas9核酸内切酶、一条导向RNA(sgRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)组成。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA结合形成双链RNA，引导Cas9蛋白至靶序列上，Cas9蛋白的两个功能域可以发挥内切酶的切割作用，即HNH和RuvC结构域，分别切割基因组上与crRNA的互补链和非互补链，造成DNA的双链断裂(doublestrandbreak,DSB)，从而启动细胞内的DNA损伤修复机制，导致修复后发生插入/缺失(indel)，达到移码突变的效果，最终实现基因敲除的目的，目前该技术已经成熟的运用于原核及真核生物的基因组编辑中。

非特异免疫是脊椎动物抵抗病毒侵入的第一道防线，干扰素系统则是机体非特异免疫抵抗感染和清除病毒的主要功能分子体系，而PKR(Double-stranded RNA-dependentprotein kinase，PKR)是干扰素系统抗病毒作用的主要效应分子。PKR分子由N端的双链RNA结合结构域(Double-stranded RNA binding domain,dsRBD)和C端的激酶结构域(Kinasedomain,KD)串联而成，dsRBD和KD通过一个链接区(Linker)连接起来。PKR可识别和结合病毒的双链RNA，然后通过二聚化和自磷酸化激活其自身的蛋白激酶活性，活化的PKR能够磷酸化真核细胞翻译起始因子2α(eIF2α)，从而使其失去蛋白翻译起始活性，导致蛋白翻译起始的失败，引起蛋白翻译的抑制。因此，PKR一方面能抑制病毒RNA的复制，另一方面能抑制病毒和宿主细胞蛋白质的合成，最终导致病毒繁殖的抑制和感染病毒细胞的凋亡，并引起机体抗病毒免疫反应，限制病毒在体内的扩散。

本公开发明人发现，斑马鱼PKR在抑制病毒蛋白翻译的同时，也存在抑制斑马鱼抗病毒免疫相关细胞因子表达的现象，从而导致斑马鱼的抗病毒免疫功能受到限制。

发明内容

因此，本公开要解决的技术问题在于克服斑马鱼PKR因抑制斑马鱼抗病毒免疫相关细胞因子表达而导致斑马鱼的抗病毒免疫功能受到限制的缺陷，从而提供一种基因敲除载体及其构建方法与用途。

为此，本公开提供一种基因敲除载体，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段能够特异性靶向编码斑马鱼PKR链接区的基因片段。

可选的，所述DNA片段能够特异性靶向斑马鱼PKR基因中的第11位外显子。

可选的，所述DNA片段能够特异性靶向斑马鱼PKR基因中的第10位和第11位外显子。

可选的，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:3所示。

可选的，所述CRISPR/Cas9载体骨架为Cas9 mRNA体外转录载体Psp6-2Snls-spCas9和/或gRNA克隆与体外转录载体骨架p-T7-gRNA，优选为gRNA克隆与体外转录载体骨架p-T7-gRNA。