[发明专利]一种基因敲除载体及其构建方法与用途

权利要求书

1.一种基因敲除载体，其特征在于，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段能够特异性靶向编码斑马鱼PKR链接区的基因片段。

2.根据权利要求1所述的基因敲除载体，其特征在于，所述DNA片段能够特异性靶向斑马鱼PKR基因中的第11位外显子。

3.根据权利要求2所述的基因敲除载体，其特征在于，所述DNA片段能够特异性靶向斑马鱼PKR基因中的第10位和第11位外显子。

4.根据权利要求3所述的基因敲除载体，其特征在于，所述DNA片段的序列如SEQ IDNO:3所示。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的基因敲除载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体骨架为Cas9 mRNA体外转录载体Psp6-2Snls-spCas9和/或gRNA克隆与体外转录载体骨架p-T7-gRNA。

6.权利要求1～5中任意一项所述基因敲除载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)基于斑马鱼PKR基因中的第10位和第11位外显子序列及其后部分内含子序列，设计打靶位点，所述10位外显子序列如SEQ ID NO:1所示，所述第11位外显子序列如SEQ ID NO:2所示，所述打靶位点的靶序列如SEQ ID NO:3所示；

(2)根据SEQ ID NO:3所示核苷酸序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

(3)将所述的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列进行退火反应形成双链DNA；

(4)将所述双链DNA连入线性化的CRISPR/Cas9载体骨架，即得所述基因敲除载体。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述基因敲除载体按照如下方式连接：线性化的CRISPR/Cas9载体质粒0.5μL，双链DNA 2μL，2×Solution I 2.5μL；

可选的，所述线性化的CRISPR/Cas9载体质粒浓度为50ng/μL，所述的双链DNA的浓度为100ng/μL，16℃反应2h。

9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述退火体系包括：所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列各为5μL；

可选的，所述正向寡核苷酸序列的浓度为10μmol/L，所述反向寡核苷酸序列的浓度为10μmol/L；

可选的，所述退火反应条件包括：95℃加热5min，自然冷却至室温。

10.权利要求1～5中任意一项所述的基因敲除载体或权利要求6～9中任意一项所述的构建方法构建得到的基因敲除载体在制备增强斑马鱼抗病毒免疫功能的药物中的用途。