[发明专利]一种生产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株及其应用

说明书

本发明公开了一种生产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株及其应用，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明通过敲除酿酒酵母基因组中的非路径基因ROX1、DOS2、YJL064W、YPL062W和NEM1，使麦角甾醇积累量大幅度提升，并在此基础上对基因ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG11、CTT1加强表达，进一步提高胞内麦角甾醇的积累量，并将基因tHMG1、IDI多拷贝整合，加强前体乙酰CoA的向下转化以加强前体角鲨烯的供应，并且将POS5、ERG4、ERG2、ERG3多拷贝整合，使构建的酿酒酵母发酵72h的麦角甾醇产量可达292.60mg/L，为甾体类化合物的生物合成奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种生产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株及其应用，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

麦角甾醇(ergosterol)，又称麦角固醇，系统命名为24β-甲基胆固醇-5，7烯-3β-羟基，分子式为C₂₈H₄₄O，分子量396.66，熔点156-158℃。麦角甾醇常温下为白色针状或片状结晶，不溶于水，易溶于有机溶剂，且在空气中可被氧化。麦角甾醇对酵母的应激适应起着至关重要的作用，其衍生物具有显著的抗肿瘤和抗HIV活性；麦角甾醇也常作为药物中间体被广泛使用，如生产可的松和孕酮等药物。此外，麦角甾醇是麦角钙化醇的维生素原，具有抗氧化、抗炎等特性。在紫外照射下，麦角甾醇可以转化为维生素D2，可以应用于软骨病、骨质疏松、手脚抽搐等病的治疗。

目前，麦角甾醇的生产方法主要有2种，包括化学合成法、微生物发酵法。化学合成法制备麦角甾醇的纯度高但生产过程能耗高，对温度要求严格，污染环境，安全性差，成本高，不符合绿色生产的理念，因此这些生产工艺不被业内所推崇。微生物发酵法是利用微生物本身的内源代谢路径来天然合成麦角甾醇，该方法具有低能耗、低成本、产量高等优点，比化学合成法更适用于大规模产业化生产。但目前微生物法生产麦角甾醇仍然存在产量低的问题。

发明内容

本发明提供了一株高产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌，以酿酒酵母SQ11为出发菌株，进行了如下至少一种改进：

(1)敲除了酿酒酵母内源基因YPL062W、ROX1；

(2)敲除了酿酒酵母内源基因NEM1；

(3)将基因ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG11、CTT1单拷贝整合到酿酒酵母的YJL064W、DOS2位点；

(4)将tHMG1、IDI基因在Ty12位点多拷贝整合；

(5)将POS5、ERG4、ERG2、ERG3在Ty3位点多拷贝整合。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母SQ11已公开于论文《Enhancing SqualeneProduction inSaccharomyces cerevisiae by Metabolic Engineering and RandomMutagenesis》中。

在一种实施方式中，所述基因YPL062W的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因ROX1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述基因NEM1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述基因ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG11、CTT1、YJL064W、DOS2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。

在一种实施方式中，所述基因YJL064W、DOS2被敲除后，在DOS2位点整合基因ERG2、ERG3、ERG4和CTT1，在YJL064W位点整合基因ERG1、ERG11和ERG4。