[发明专利]一种基于数字RCR的人肺癌GFRT790M突变检测方法及其检测方法

说明书

本发明公开了基因突变检测领域的一种基于数字RCR的人肺癌GFRT790M突变检测方法，包括核酸扩增试剂和对照品，所述核酸扩增试剂包括EGFRT790M反应液，所述反应液中含有用于检测EGFR基因T790M突变的特异性引物和荧光探针，所述反应液中还包含一对上游引物和下游引物以及MGB荧光探针；所述核酸扩增试剂还包括2×QuantStudio3DDigitalPCRMix。本发明还公开了上述检测EGFR基因T790M突变的PCR试剂盒的检测方法的检测方法。本申请的试剂盒采用数字PCR技术，可对非小细胞肺癌患者组织或血浆DNA样本中的T790M突变进行定量检测，从而辅助患者的靶向用药治疗方案的制定。

技术领域

本发明涉及基因突变检测领域的一种基于数字RCR的人肺癌EGFR T790M突变检测方法。

背景技术

肺癌一直以来位居全球癌症相关死亡首位。美国癌症协会发布的数据显示，2014年全美新发肺癌224210例，位居癌症第二位，其中非小细胞肺癌占80％。尽管化疗取得了一些进步，但目前以铂类为基础的最有效化疗方案的中位生存时间也不会超过10个月。近年来，EGFR络氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的广泛应用使非小小细胞肺癌的治疗获得很大进步。目前第一代EGFR络氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼广泛应用于NSCLC的治疗。它们可逆地与ATP结合位点结合，从而阻止了EGFR下游通路的激活。

虽然在EGFR-TKI使用之初效果显著，但是多数患者最终都会在使用后9-10个月发生耐药或病情进展。在2005年对于EGFR-TKI耐药患者的病例分析中首次提到了T790M突变。耐药后标本的20外显子上密码子790中的C到T碱基的突变使得相应苏氨酸(T)被甲硫氨酸(M)取代，此关键位置的氨基酸的改变使得已有的L858R突变的激酶结构域对ATP亲和力反超EGFR-TKI，使EGFR-TKI在和ATP的竞争中处于弱势而无法继续阻断EGFR的信号通路，即表现为耐药或疾病进展。

最近几年，针对该突变的以奥希替尼为代表的第三代TKI进入大家的视线，由于其临床疗效及可耐受的毒副作用，FDA加速审批，批准其可作为一代TKI耐药后的治疗策略。奥希替尼一种不可逆的三代EGFR-TKI，可以选择性地抑制EGFR敏感突变和T790M突变。2017年3月，奥希替尼在华上市，开创了EGFR-TKI耐药后T790M阳性患者的精准治疗新时代。随着该药物的上市，如何敏感、准确地检测T790M突变成为临床关注的热点。

《2016年的晚期原发性肺癌诊治专家共识》建议有条件的患者在疾病进展时应再次进行肿瘤组织活检，并进行病理和相关的基因检测以明确耐药的性质。目前，T790M检测方法主要包括：①扩增阻滞突变系统法(amplified refractory mutation system，ARMS)；②聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)；③二代测序法(next-generationsequencing，NGS)。ARMS法只能检测已知突变，方便快捷、特异度高，在临床广泛应用；而NGS是近年发展起来的高通量深度测序技术群，可一次性对几百万条至十亿条DNA分子进行并行测序，但对稀有突变及结构变异不敏感且价格昂贵，广泛应用仍受到限制。在标本选择上可有：组织、恶性胸水及血液，临床中多因组织获取困难，更多选择液体活检，NCCN等多项指南已经推荐使用NGS进行液体检测。Oxnard等研究指出，一代TKI治疗后失败的NSCLC患者若检测出T790M突变阳性患者的进展后生存期显著长于无T790M突变患者。因此，T790M突变既是EGFR-TKI耐药的原因之一，也因为其可选择三代TKI进行后续治疗而因此成为进展后生存的良好预后因子。动态检测T790M突变可能预测未来的耐药，可以进一步探究T790M突变诱导的耐药机制，并指导进展期NSCLC患者的治疗，但其中细则问题需要更多研究来论证，为使NSCLC治疗更个体化、更精准化，也需要血液T790M突变检出率灵敏度、特异性的提高。