[发明专利]一种基于数字RCR的人肺癌GFRT790M突变检测方法及其检测方法

权利要求书

1.一种基于数字RCR的人肺癌EGFR T790M突变检测方法，其特征在于，所述突变检测方法采用T790M突变的PCR试剂盒,T790M突变的PCR试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，所述核酸扩增试剂包括反应液，所述反应液中含有用于检测EGFR基因T790M突变的特异性引物和荧光探针，所述特异性引物还包含一对上游引物和下游引物，所述荧光探针为MGB荧光探针，所述MGB荧光探针还包括野生型探针和突变型探针；所述特异性引物和荧光探针的序列与修饰如下：

上游引物5’-ACGTGTGCCGCCTGCT-3’

下游引物5’-TTGTGTTCCCGGACAT-3’

野生型探针5’-FAM-TCATCACGCAGCTC-MGB-3’

突变型探针5’-FAM-TCATCATGCAGCTC-MGB-3’；

所述核酸扩增试剂还包括2×QuantStudio 3D Digital PCR Mix。

2.根据权利要求1所述的一种基于数字RCR的人肺癌EGFR T790M突变检测方法，其特征在于，所述反应液中包含的特异性引物含量为900nmol/L，荧光探针含量为250nmol/L。

3.根据权利要求1所述的一种基于数字RCR的人肺癌EGFR T790M突变检测方法，其特征在于，所述QuantStudio 3D Digital PCR Mix为2×工作液，配制时加入量为总体系量的一半。

4.根据权利要求1-3任一所述的一种基于数字RCR的人肺癌EGFR T790M突变检测方法，其特征在于，所述对照品还包括阳性对照和阴性对照。

5.根据权利要求4所述的一种基于数字RCR的人肺癌EGFR T790M突变检测方法，其特征在于，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照为突变质粒和野生型质粒混合物。

6.根据权利要求5所述的一种基于数字RCR的人肺癌EGFR T790M突变检测方法，其特征在于，所述突变质粒所包含的EGFR基因片段序列如下：

GCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCTCACATGC。

7.基于如权利要求1-6任一所述的一种基于数字RCR的人肺癌EGFR T790M突变检测方法，其特征在于，包含步骤如下：

(1)根据不同样本类型选择相应商业DNA提取试剂盒进行DNA的提取，作为检测的模板；

(2)配制EGFR T790M检测3D数字PCR反应体系，体系包含：

(3)使用芯片上样仪，将上述反应体系取14.5μL均匀分布到PCR芯片上；

(4)将芯片放置到PCR仪上进行扩增，扩增程序为：

(5)扩增完成，取出芯片；将芯片放置到芯片读取仪内进行扫描；

(6)扫描结束，将数据上传至服务器，划定阈值完成结果的分析。