[发明专利]一种基因编辑酵母体外合成麝香酮的方法

说明书

本发明公开了一种基因编辑酵母体外合成麝香酮的方法，包括以下步骤：丙二酰‑酰基载体蛋白质与2‑酮异戊酸盐在硫胺素代谢调节蛋白的作用下，形成2‑甲基丙烯‑ACP，并在脂肪酸合酶FAS1/FAS2的作用下，延伸合成14‑甲基‑十五酰‑辅酶A，在TES1的作用下，产生14‑甲基‑十五烷酸；14‑甲基‑十五烷酸在CYP54A1、CYP54A13或CPR2的作用下发生ω‑羟基化，形成ω‑羟基‑14‑甲基‑十五烷酸；ω‑羟基‑14‑甲基‑十五烷酸在内酯脂肪酶催化下形成麝香酮。本发明构建了全新的麝香酮生物合成途径，通过基因编辑技术使酵母获得合成麝香酮的能力，合成产量可以达到843mg/L，成本低，可量产。

技术领域

本发明属于麝香酮合成技术领域，具体涉及一种基因编辑酵母体外合成麝香酮的方法。

背景技术

麝香酮不仅是名贵中药麝香的重要成分，也是一种重要的香料。目前麝香酮的主要生产方法有两种：

第一种是通过饲养麝科动物林麝（Moschus berezovskii），通过活体取香，即把成熟雄体香囊中的干燥分泌物麝香经蒸馏提取，得到麝香酮。然而，该方法存在由于资源少，近亲繁殖导致品种退化进而导致麝香产量下降的问题；其次，雄麝的泌香具有年周期性，一年之中在5～7月份泌香一次，麝香年产量只有10克左右。同时随着林麝年龄增长，麝香的质量与产量也会下降。因此，通过林麝养殖的方法难以大批量地获得麝香酮。

第二种是化学合成麝香酮。目前主要通过环十五烷酮的甲基化、闭环法和环酮扩环法三种化学方式来合成麝香酮。环十五烷酮的甲基化是在环十五烷酮β位插入甲基而得到麝香酮的方法。但这种方法依赖于环十五酮的价格，目前环十五酮的价格还是比较昂贵的。闭环法主要是通过开链化合物分子内闭环来合成麝香酮，主要包括羟醛缩合闭环法、醇酮缩合闭环法、Dieckman缩合闭环法、分子内酰化闭环法、自由基加成闭环法、Prins反应闭环法、Emmons-Horner反应闭环法、分子内1-3偶极加成闭环法、分子内亲和取代闭环法、端炔氧化偶联闭环法等。然而该方法反应周期长，操作复杂，产率极低，总产率只有5%。环酮扩环法是以环十二酮为原料在其α位引入一个取代的异丁基（或甲基丙稀）结构侧链，通过扩环形成麝香酮。该方法虽然底物原料便宜，但合成环境要求高，路线复杂。

综上，当前生产麝香酮的方法无论是通过养殖林麝还是通过各种途径的化学合成，其缺点都很明显。通过人工养殖林麝来获得麝香酮，产物很少，周期长，成本高；化学合成则具有产率低，操作复杂，路线复杂，合成环境要求高，周期长等缺点。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供的基因编辑酵母体外合成麝香酮的方法通过改造酵母，建立高效生物合成麝香酮体系，从而降低了麝香酮合成的成本及操作难度。

为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

提供一种基因编辑酵母体外合成麝香酮的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）支链脂肪酸合成：丙二酰-酰基载体蛋白质（丙二酰-ACP）与2-酮异戊酸盐（2-KIV）在THI3的作用下，形成2-甲基丙烯-ACP，并在脂肪酸合酶FAS1/FAS2的作用下，延伸合成14-甲基-十五酰-CoA，在TES1的作用下，产生14-甲基-十五烷酸；

（2）ω-羟基化：14-甲基-十五烷酸在CYP54A1、CYP54A13或CPR2的作用下发生ω-羟基化，形成ω-羟基-14-甲基-十五烷酸；

（3）环化成酮：ω-羟基-14-甲基-十五烷酸在内酯脂肪酶（Lactonizing lipase，LipL）催化下形成麝香酮。

进一步地：步骤（1）中，通过过表达THI3、FAS1、FAS2、TES1基因，增加14-甲基-十五烷酸的合成产量；同时通过敲除ADHs与FAO基因，减弱脂肪酸还原醇化或氧化，从而进一步增加14-甲基-十五烷酸的合成产量。

进一步地：ADHs基因包括ADH-A4、ADH-A10、ADH-B2、ADH-B4、ADH-B1。