[发明专利]一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法

说明书

本发明涉及基因敲除技术领域，并提供一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，先进行酵母基因序列的构建，构建好的酵母基因序列扩增为用于酵母转化的基因组件，在扩增过程中进行酵母的转化，酵母转化，在扩增的基因组件上实现对A基因的敲除，酵母筛选标记基因敲除完成。该用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法以构建到pBridge载体上的X(MCSII位点)、Y(MCSI位点)基因为诱饵，筛选酵母三杂交某物种文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7‑X‑Y相互作用的蛋白，该实验方法能够快速高效的确定所需的蛋白，且实验过程清楚易操作，从而大大推进了筛选与pBridge‑X‑Y相互作用蛋白技术领域的发展。

技术领域

本发明涉及基因敲除领域，具体为一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法。

背景技术

基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术，它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能为此现提出一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术，它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法，这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命，尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值，基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，由以下具体技术手段所达成：

本发明为实现技术目的采用如下技术方案：一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，其特征在于：具体步骤为：

S100、选定酵母基因组序列；

S101、构建用于酵母转化的基因组件；

S102、实现对A基因的敲除；

所述酵母基因序列包含有ATG原始密码子与TGA终止密码子。

优选的，所述用于酵母转化的基因组件先扩增为三个片段，然后三个片段进行重组成BO等初始载体，重组后的BO等初始载体再次转化阳性菌，其中提质粒为PCR模板，重组扩增重组组件用于酵母转化。

优选的，所述酵母转化具体包含以下步骤：

S200、从接种在YPD斜面上的S.s挑取单菌落；

S201、接种单菌落至50mLYPD培养基的500mL三角瓶中，25℃，200rpm，培养过夜至OD600值在1.0-1.5之间；

S202、吸取培养液按5％接种量接种至50mLYPD培养基的500mL三角瓶中，25℃，200rpm，培养至OD600值在0.8-1.0之间；4500rpm，离心5min，收集菌体；

S203、将菌体与新鲜配制的8mL酵母细胞感受态母液轻轻混匀后，室温放置30min，每10min轻轻摇匀一次；

S204、4500rpm，离心5min，收集菌体；

S205、用2mL的预冷的1M山梨醇重悬，然后于4℃条件下，4000rpm，离心5min，收集菌体，重复三次；