[发明专利]一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法

权利要求书

1.一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，其特征在于：具体步骤为：

S100、选定酵母基因组序列；

S101、构建用于酵母转化的基因组件；

S102、实现对A基因的敲除；

所述酵母基因序列包含有ATG原始密码子与TGA终止密码子。

2.根据权利要求1所述的一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，其特征在于：所述用于酵母转化的基因组件先扩增为三个片段，然后三个片段进行重组成BO等初始载体，重组后的BO等初始载体再次转化阳性菌，其中提质粒为PCR模板，重组扩增重组组件用于酵母转化。

3.根据权利要求1所述的一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，其特征在于：所述酵母转化具体包含以下步骤：

S200、从接种在YPD斜面上的S.s挑取单菌落；

S201、接种单菌落至50mLYPD培养基的500mL三角瓶中，25℃，200rpm，培养过夜至OD600值在1.0-1.5之间；

S202、吸取培养液按5％接种量接种至50mLYPD培养基的500mL三角瓶中，25℃，200rpm，培养至OD600值在0.8-1.0之间；4500rpm，离心5min，收集菌体；

S203、将菌体与新鲜配制的8mL酵母细胞感受态母液轻轻混匀后，室温放置30min，每10min轻轻摇匀一次；

S204、4500rpm，离心5min，收集菌体；

S205、用2mL的预冷的1M山梨醇重悬，然后于4℃条件下，4000rpm，离心5min，收集菌体，重复三次；

S206、然后用200-250μL预冷的1M山梨醇重悬，分装至1.5mL离心管中，每管60-80μL；

S207、冰上预冷0.2cm电击杯，打开电击仪，调整参数：电压1.5KV/mm，时间5ms；

S208、向感受态细胞中加入10ug DNA片段，轻柔吸打混匀后转移至电击杯中，电击结束后立即加入1mL预冷的1M山梨醇，吸打混匀后转移至离心管中，25℃孵育1h；

S209、室温下800g离心3min，用200μL 1M山梨醇重悬，涂布于含NTC的YPD平板，25℃倒置培养3-7天。

4.根据权利要求1-3所述的一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，其特征在于：所述基因敲除方法的具体步骤如下：

S300、先进行酵母基因序列的构建；

S301、构建好的酵母基因序列扩增为用于酵母转化的基因组件；

S302、在扩增过程中进行酵母的转化，酵母转化；

S303、在扩增的基因组件上实现对A基因的敲除；

S304、酵母筛选标记基因敲除完成。