[发明专利]微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组、探针及应用

说明书

本发明提供微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组、探针及应用，属于禽圆环病毒2型检测技术领域，所述引物组包括上游引物AGV2‑F和下游引物AGV2‑R，探针为AGV2‑P，检测过程为参考GenBank中AGV2的VP基因保守序列，设计筛选了特异性探针和引物，通过对反应条件的优化，评估特异性、敏感性和重复性试验。本发明对其他常见鸡病病原体进行检测，均为阴性，且灵敏度达到了3.2个拷贝/反应，是荧光PCR和普通PCR的10倍和100倍，具有很高的敏感性，满足病毒快速检测的要求。

技术领域

本发明涉及禽圆环病毒2型检测技术领域，尤其涉及微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组、探针及应用。

背景技术

禽圆环病毒2型AGV2是2011年Rijsewijk等人首次在巴西的病鸡中发现的一种新发传染病。AGV2是鸡传染性贫血病毒(CAV)相关的环形病毒。同年，与AGV2序列同源性较高的一种人类病毒(HGyV)在法国人群的皮肤中被检出。2015年，新型环形病毒AGV2首次在中国内地的鸡群和健康的人群中发现。Bullenkamp等研究表明AGV2的VP3蛋白与CAV的VP3蛋白结构类似，能诱导癌细胞凋亡。AGV2已经在不同的地区(如意大利、南非、美国、巴西和荷兰)被检测到，这表明该病毒分布范围比较广。此外，一项检测市场销售的家禽疫苗是否被AGV2污染的研究中发现，巴西、加拿大和荷兰产的32株活性疫苗中发现有9株疫苗含有AGV2，这可能是造成AGV2分布范围比较广的原因。越来越多的证据表明AGV2对鸡和人均具有感染性，这不仅对家禽业而且对人类的健康也构成了巨大的潜在威胁。

目前，针对AGV2的检测方法很多，其中，鸡胚病毒分离与鉴定是确诊该病的“金标准”，但病毒分离培养操作繁琐，所需要的时间较长，影响其有效分离到病毒的因素较多；PCR和荧光定量PCR方法较为常用，但其灵敏度仍有待提高，特别是在病毒含量极低时常会出现假阴性或可疑结果的情况，所以有必要建立一种灵敏度更高、更准确的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组、探针及应用，解决背景技术中提到的技术问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针，所述引物组和探针的核苷酸序列如下所示：

上游引物AGV2-F：5’GACGATGGAGGAGTCACTGGTT 3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物AGV2-R：5’GTCCGTCTGGGTYTCCTGTGT 3’(SEQ IDNO：2)；

探针AGV2-P：5’FAM-CAGGAGGCTAGTGGACT-BHQ13’(SEQ ID NO：3)。

进一步地，所述上游引物AGV2-F、下游引物AGV2-R和探针AGV2-P的摩尔比为9:9:5。

微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩增中的应用，退火温度为54.0℃。

微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩增中的应用，总的扩增体系为20μL：dd PCRTMSupermix forProbe 10μL，设置6个不同引物探针组合，浓度为600、600、900、900、1200、1200nmol/L上下游引物各1μL，对应浓度梯度为150、300、250、500、350、600nmol/L的探针1μL，模板2μL，最后用ddH₂O补足20μL反应体系。

进一步地。在PCR扩增中，ddPCR反应程序为：95℃预变性10min；94℃30s，退火温度60.0～50.0℃，40个循环，98℃固化10min，4℃结束反应，升降温度设置2.0℃/s。