[发明专利]一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种检测T7RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA。本发明创造性提出一种检测T7RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法，利用T7RNA聚合酶进行转录反应，并通过检测反应生成焦磷酸的量计算待测T7RNA聚合酶的活性，检测过程操作简单、周期短且成本低，同时具备高灵敏度和准确性，对于实现T7RNA聚合酶活性的高通量、自动化检测具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法。

背景技术

T7 RNA聚合酶是一类依赖于DNA的RNA聚合酶，并对T7噬菌体启动子有高度特异性。T7启动子是一段具有高度保守的20bp序列，该序列带有RNA转录起始位点。T7 RNA聚合酶对启动子的高度特异性不仅是T7噬菌体侵染的关键，对生物学家来说，还具有非常大的潜在应用价值，例如，T7 RNA聚合酶可以将插入到T7启动子后的DNA序列进行转录，产生大量特异的RNA序列，转录生成的RNA在杂交探针、体外翻译模板、包括RNA剪接和聚腺苷化的转录后修饰过程的研究、以及RNA结构、加工和催化研究等方面具有非常大的利用价值。

由于T7 RNA聚合酶应用领域较广泛，因此准确标定T7 RNA聚合酶的活性，保证各个批次间活性的稳定，具有重要的意义。传统的T7 RNA聚合酶活性测定方法通常采用同位素法，同位素法容易产生放射性污染，对检测设备要求高，操作成本高，难以实现高通量。

综上所述，如何开发一种简单、高效的T7 RNA聚合酶的活性检测方法，有助于实现高通量和自动化的活性检测，且具备高灵敏度和准确性，是T7 RNA聚合酶研究领域亟需解决问题之一。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法，利用待测T7 RNA聚合酶以含有T7启动子的双链DNA为模板进行转录反应，发现在一定范围内T7 RNA聚合酶的活性与反应体系中焦磷酸的量呈正比，因此，可通过检测反应体系中焦磷酸的量检测T7 RNA聚合酶活性，方法简单、成本低，且具备高灵敏度和准确性，有利于广泛推广应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA。

本发明的试剂盒中包括核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA，将其与待测T7RNA聚合酶混合后控制温度即可进行转录反应，双链DNA转录模板在T7 RNA聚合酶作用下，转录生成大量RNA链，并伴随着大量焦磷酸的产生，本发明发现在一定范围内T7 RNA聚合酶的活性与反应体系中焦磷酸的量呈正比，因此可通过T7 RNA聚合酶标准品建立T7 RNA聚合酶活性和焦磷酸的量的对应关系的标准曲线，进而通过检测待测T7 RNA聚合酶催化转录反应生成焦磷酸的量计算待测T7 RNA聚合酶的活性，检测原理示意图如图1所示。

优选地，所述核苷三磷酸包括三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷和三磷酸尿苷。

根据本发明，能够作为转录模板的含有T7启动子的双链DNA均能应用于本发明的试剂盒。

优选地，所述含有T7启动子的双链DNA的长度为200～1500bp，包括但不限于201bp、202bp、203bp、204bp、210bp、220bp、250bp、300bp、400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp、1300bp、1400bp、1450bp、1480bp或1490bp。

优选地，所述含有T7启动子的双链DNA的核酸序列包括SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的序列。

SEQ ID NO.1：