[发明专利]检测粪便中幽门螺杆菌的引物和探针及其试剂盒

说明书

本发明通过对幽门螺杆菌特异基因的比对，提供了用于从粪便中检测幽门螺杆菌的实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1，SEQID NO:2，SEQ ID NO:3所示，本发明还提供了粪便中幽门螺杆菌进行定量检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的标本检测能力。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于从粪便中检测幽门螺杆菌的荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用所述引物和探针序列从粪便中检测幽门螺杆菌的方法和试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)是引起消化系统疾病的最重要的感染因子，与胃部多种疾病相关，比如胃炎、胃溃疡、MALT淋巴瘤和胃癌，它是世界卫生组织(WHO)癌症协会规定的第I类致癌因子。

幽门螺杆菌感染诊断有多种方法，分为无创检测方法和有创的检测方法。比如细菌分离培养、血清学、快速尿素酶试验、尿素呼气试验。这些方法各有利弊。分离培养方法技术难度大，耗时耗力。血清学方法不能很好的证明是不是正在感染。快速尿素酶必须依赖胃镜，同时市场上的试剂的结果一致性不够好。现在用的最多的就是尿素呼气试验，其灵敏度和特异性受到认可，然而其检测所用¹³C或者¹⁴C尿素原料要求高，价格高，再加上其检测通量受限，进一步限制了其在大规模人群筛查中的可行性。从幽门螺杆菌防控的角度看，未来需要一种无创的，并且具备高通量检测能力，具备国内自主知识产权的检测方法。从技术角度出发，最合适的方法就是以粪便为标本的实时荧光PCR的方法。人类的胃黏膜细胞每2～3日有部分脱落更新，胃黏膜上的幽门螺杆菌也会随之脱落，最后随粪便排出体外。因此在粪便中检测幽门螺杆菌是非常可行的。近年来，实时荧光PCR由于其良好的灵敏度和特异性，越来越广泛的应用于临床传染病检测。

目前有多篇文献报道了幽门螺杆菌实时荧光PCR的检测方法，其靶基因主要有16SrDNA，23S rDNA，cagH等(参考文献①Rike Syahniar,Mardiastuti H Wahid,Ari FahrialSyam,et al.Detecting the Helicobacter pylori 16S rRNA Gene in DyspepsiaPatients Using Real-Time PCR.[J]Acta Med Indones.2019 Jan；51(1):34-41.②石建玲,程波,刘珊,et al.基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,[J]中国实验诊断学,2013,17(6),986-989.③刘国栋.基于胃黏膜多重Real time PCR的幽门螺杆菌根除药物选择技术的建立与评价[D].中国疾病预防控制中心,2011.)。这些方法主要针对胃黏膜标本或者已经分离到的菌株，众所周知，胃黏膜中的幽门螺杆菌含量远远高于粪便，所以之前文献发表的引物和探针灵敏度不能达到直接在粪便种检测幽门螺杆菌的需求。

综上所述，幽门螺杆菌感染的检测发展方向必定是无创、快速、高通量。针对这种情况，我们开发了一种用于粪便幽门螺杆菌检测的实时荧光PCR技术。

发明内容

本发明的目的在于提供用于粪便中幽门螺杆菌检测的实时荧光PCR的特异性引物和探针；本发明目的还在于提供上述引物和探针的用途，以实现从粪便中检测幽门螺杆菌感染的能力。

为实现上述目的，通过对NCBI数据库已报道的幽门螺杆菌黏附素基因alpB 序列比对，特别是中国菌株的比对，找到特异性的保守靶序列，发现了核苷酸完全保守区域95bp：nt 1047-nt 1142(相对于幽门螺杆菌标准菌株ATCC26695)，该靶序列是检测幽门螺杆菌的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测幽门螺杆菌的遗传标记物。