[发明专利]一种IPTG诱导性缺失D1133L基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其应用有效
| 申请号： | 202210258522.6 | 申请日： | 2022-03-16 |
| 公开（公告）号： | CN114958782B | 公开（公告）日： | 2023-03-24 |
| 发明（设计）人： | 郑海学;张克山;张婷;冯涛;杨博;杨行;史喜绢;田宏;茹毅;杨帆;朱紫祥;郭建宏;何继军;刘湘涛 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N7/01 | 分类号： | C12N7/01;C12N15/34;C12N15/85;C12N15/65;C12R1/93 |
| 代理公司： | 郑州大通专利商标代理有限公司 41111 | 代理人： | 张立强 |
| 地址： | 730046 *** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 iptg 诱导性 缺失 d1133l 基因 非洲 猪瘟 病毒 减毒株 及其 应用 | ||
1.一种IPTG诱导性缺失D1133L基因的非洲猪瘟病毒减毒株，其特征在于，利用大肠杆菌lac操纵基因-阻遏物系统，通过IPTG诱导性缺失野生非洲猪瘟病毒的D1133L基因得到非洲猪瘟病毒减毒株；无IPTG存在时，所得到的非洲猪瘟病毒减毒株的D1133L蛋白的表达被抑制；
所述非洲猪瘟病毒减毒株制备方法为：将D1133L基因的下游序列和D117L上游序列克隆入pUC118中分别作为左右同源臂，然后在左右同源臂之间插入p72-eGFP-U104L-LacI-p72-LacO筛选表达盒，得到同源重组转移载体；接着将同源重组转移载体与野生非洲猪瘟病毒进行同源重组，使p72-eGFP-U104L-LacI-p72-LacO筛选表达盒插入到野生非洲猪瘟病毒的D1133L之前得到重组病毒ASFV vD1133Li即为非洲猪瘟病毒减毒株；
在不存在IPTG的情况下，ASFV vD1133Li感染过表达D1133L的MA-104/D1133L细胞和野生型MA-104细胞，MA-104/D1133L细胞中p30和p72蛋白表达量显著高于MA-104；
其中，筛选表达盒构建步骤为：扩增eGFP基因和p72启动子；合成利用U104L启动子启动的LacI，以及由p72启动合成的LacO，将p72启动子、eGFP、U104L-LacI、p72-LacO连接，得到筛选表达盒，命名为p72-eGFP-U104L-LacI-p72-LacO；
同源重组转移载体的构建步骤为：设计将D1133L基因的下游序列和D117L上游序列作为左同源臂和右同源臂，分别克隆入骨架载体pUC118载体中，然后在左右同源臂之间插入p72-eGFP-U104L-LacI-p72-LacO筛选表达盒，得到同源重组转移载体命名为pUC-p72-eGFP-U104L-LacI-p72-LacO；所述左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述筛选表达盒p72-eGFP-U104L-LacI-p72-LacO的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述野生非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS 2018，所述D1133L基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示，野生非洲猪瘟病毒ASFV CN/GS 2018的保藏编号为CCTCC NO: V202096。
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