[发明专利]一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法

说明书

本发明提供了一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法，包括：S1：设计制备RNA交联的DNA水凝胶；S2：制备自驱动DNA水凝胶传感器；S3：设计合成的特异性的crRNA；S4：将crRNA、Cas13a蛋白和靶标RNA共同孵育含有已知浓度的靶标RNA分子样品溶液；S5：将自驱动DNA水凝胶传感器水平浸入含有已知浓度的靶标RNA分子样品溶液；S6：通过S5中样品溶液在毛细管中的移动距离，构建靶标RNA分子浓度与移动距离之间的线性对应关系；S7：进行可视化检测及定量分析，本发明利用溶液在毛细管中的距离便可实现无需核酸扩增，可视化的RNA定量检测，为RNA为靶标的分子诊断、疾病检测提供新工具。

【技术领域】

本发明涉及分子诊断与生化分析方法研究领域，尤其涉及一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法。

【背景技术】

RNA分子作为重要的遗传信息载体，由于它们在众多生物过程中的重要作用，从基础生物化学研究到临床诊断的各个领域，RNA分子的特异性和灵敏检测变得越来越重要。例如，基于新型冠状病毒（SRAS-CoV-2）RNA的核酸检测，作为新型冠状病毒病(COVID-19)诊断的金标准，在COVID-19大流行的预防和控制中发挥着至关重要的作用。

目前RNA检测方法主要分为直接检测和基于核酸扩增的检测。RNA直接检测的主要包括Northern印迹，荧光原位杂交（FISH），DNA微阵列等，这些方法在具有高特异性，但这些方法通常存在繁琐且耗时的实验程序且灵敏度不高。基于核酸扩增的RNA检测方法，包括逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）以及多种等温核酸扩增技术。然而，这些方法通常需要逆转录/连接步骤以将RNA转化为DNA，以及随后的DNA复制步骤以产生可检测的核酸水平。但扩增步骤往往会引入一些比较棘手的问题，例如由于逆转录不完全导致的目标 RNA分子丢失、易错序列复制导致的扩增偏差以及污染导致的假阳性结果。此外，需要精心设计多个靶标特异性探针/引物，严格优化实验条件。

因此，有必要研究一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法来应对现有技术的不足，以解决或减轻上述一个或多个问题。

【发明内容】

鉴于此，本发明提供了一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法，利用溶液在毛细管中的移动距离便可以实现无需核酸扩增，可视化的RNA定量检测，为RNA为靶标的分子诊断、疾病检测提供新工具。

一方面，本发明提供一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法，所述RNA定量检测方法包括：

S1：设计制备CRISPR-Cas13系统响应RNA交联的DNA水凝胶；

S2：将S1制备的DNA水凝胶固定在毛细管末端形成超薄DNA水凝胶薄膜，由超薄DNA水凝胶薄膜与毛细管共同组成自驱动DNA水凝胶传感器；

S3：设计合成与靶标RNA分子特异性的crRNA；

S4：将crRNA、Cas13a蛋白和靶标RNA在适当缓冲溶液中共同孵育后，获得含有已知浓度的靶标RNA分子样品溶液；

S5：将自驱动DNA水凝胶传感器水平浸入含有已知浓度的靶标RNA分子溶液；

S6：通过S5中溶液在毛细管中的移动距离，构建靶标RNA分子浓度与移动距离之间的线性对应关系；

S7：将自驱动DNA水凝胶传感器水平浸入含有靶标RNA分子待测样品溶液，根据S6中线性对应关系对待测样品中靶标RNA分子溶液进行可视化检测及定量分析。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述S1具体包括：

S11：设计合成两条acrydite修饰的DNA链，A-DNA-X和A-DNA-Y；