[发明专利]纹状体类脑器官及其培养基、培养方法和应用

说明书

本发明涉及一种纹状体类脑器官及其培养基、培养方法和应用。本发明利用纹状体发育过程中经典的Sonic hedgehog信号通路的激活来产生类器官，诱导三维分化体系中人胚胎干细胞向纹状体类脑器官分化，在培养过程中，在所述培养基加入适量的SHH，能够成功获得长期存活、类似于体内早期发育过程中的纹状体原基、具有相应生物性能的纹状体类脑器官，其在筛选药物、疾病研究或临床研究上具有广泛的用途。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一纹状体类脑器官及其培养基、培养方法和应用。

背景技术

人胚胎干细胞具有多能性，具有分化为任何胚层细胞类型的能力。近年来，人胚胎干细胞被报道能够自我组装形成三维类器官结构，例如肝脏、肾脏、小肠、心脏；以及大脑的特定区域前脑、中脑、海马、下丘脑、视网膜。这些类器官能够很好地模拟人类的发育过程、细胞组成及结构，为研究细胞命运特化、模拟细胞-细胞相互作用关系以及探究疾病机理提供了相对理想可靠的模型和药物筛选平台。

纹状体类器官在发育模型和药物筛选方面具有很大的发展潜力，开发多种不同的培养体系来产生纹状体类脑器官是很有必要的。但是目前很少文献报道纹状体三维类脑器官生成方案，并且采用的是激活发育过程中的ActivinA和视黄醇类X受体信号通路的方式来产生纹状体类脑器官[Miura Y,Li MY,Birey F,Ikeda K,Revah O,Thete MV,Park JY,Puno A,Lee SH,Porteus MH,Pasca SP.Generation of human striatal organoids andcortico-striatal assembloids from human pluripotent stem cells.Nat Biotechnol2020,38(12):1421-1430.]。

因此，我们通过合适的顺序暴露人胚胎干细胞于纹状体发育过程中的生长因子、化学小分子激活剂和抑制剂，开发新的可以在体外产生类似发育过程中形成的纹状体类器官培养体系。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种纹状体类脑器官的培养方法，以及培养基，通过这些培养基和培养方法，可以成功获得可长期培养的纹状体类脑器官。

包括技术方案如下：

本发明的目的之一，在于提供一种诱导纹状体类脑器官产生的培养基。

一种诱导纹状体类脑器官产生的培养基，其为在PM培养液中添加有SHH因子。

在其中一些实施例中，所述SHH因子在PM培养液中的浓度为200±50ng/ml。

在其中一些实施例中，所述SHH因子在PM培养液中的浓度为200±5ng/ml，在其中一优选实施例中为200±1ng/ml，更优选为200ng/ml。

在其中一些实施例中，PM培养液为含有以下浓度的成分1±0.1％(v/v)N2添加剂,2±0.2％(v/v)B27无维生素A，0.15±0.02％(w/v)葡萄糖及100±5uMβ-巯基乙醇的DMEM/F12培养基中。

本发明的目的之二，在于提供一种纹状体类脑器官的培养方法。

一种纹状体类脑器官的培养方法，包括以下步骤：

S1.使用细胞消化液Accutase孵育人胚胎干细胞(hESC)后，将hESC解离成单细胞悬液，在神经诱导培养基NIM中进行培养，每隔45-52小时更换新的神经诱导培养基NIM；

S2.在培养10±0.5天时，将细胞转移到低吸附的孔板中，换成上述诱导纹状体类脑器官产生的培养基中进行培养；每隔45-52小时更换新的述诱导纹状体类脑器官产生的培养基，直到分化第18±0.5天；

S3.然后将细胞更换到新的DM培养液中进行培养，即得所述纹状体类脑器官。