[发明专利]基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方法

说明书

本发明涉及一种基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方法，试剂盒含有以下特异性引物：上游外引物F3如SEQ ID NO.1所示，下游外引物B3如SEQ ID NO.2所示，上游内引物FIP如SEQ ID NO.3所示，下游内引物BIP如SEQ ID NO.4所示，上游环引物LF如SEQ ID NO.5所示，下游环引物LB如SEQ ID NO.6所示。本发明设计一条特有的LAMP引物对沙门氏菌进行检测，同时结合短时间增菌和MPN计数建立了mini‑MPN‑LAMP沙门氏菌快速定量检测方法；本发明灵敏度高，特异性好，操作简单快速，准确可靠，检测成本低。

技术领域

本发明属于食品微生物技术领域，涉及一种食品微生物检测试剂盒及其检测方法，具体地说是涉及一种基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方法。

背景技术

基因的选择对于沙门氏菌的鉴定至关重要。invA基因是沙门氏菌属检测最常用的目标基因。该基因编码位于沙门氏菌致病岛(SPI)上的入侵蛋白，在沙门氏菌致病过程中起着重要的作用，是侵袭宿主细胞所需的毒力因子，大多数已发表的文献和商品化的试剂盒都以invA基因作为靶基因进行检测。

近年来，TURKI等发现分离出的12.3％的S.enterica serovar Kentucky分离株无法检测出invA基因，另外，S.enterica serovar Litchfield和Senftenberg等菌株在自然界中也可能会缺失invA，通过生物信息学分析和综合测试评价发现invA在沙门氏菌中的特异性能只能达到97.6％～97.8％。

根据沙门菌属特有的靶序列肠毒素基因序列，设计2对特殊的内、外引物(内引物FIP与BIP，外引物F3与B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，为增加反应速度，还设计1对环引物(LF与LB)。利用Bst DNA聚合酶启动循环链置换反应，在肠毒素基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物(焦磷酸镁)形成白色沉淀，同时反应液pH会降低，最终可通过颜色变化观察判定结果。

MPN计数法是一种基于概率计算的计数方法，使用上比平板计数法更具灵活性，对培养基的选择性要求低，检出限可根据加样量进行调整，因此MPN计数法广泛用于食品中大肠菌群、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌等微生物的定量检测。虽然国家标准GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》中未制定沙门氏菌的定量检测方法，但在美国分析化学家协会(AOAC)、美国环保局(EPA)等机构制定的国际标准中均有沙门氏菌MPN计数法的使用，可见MPN计数法在定量检测沙门氏菌的重要地位；但是，试管法的MPN计数法操作繁杂，DNA提取需要进行浓缩，时间较长。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方法。

本发明所采用的技术方案为：

一种基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒，含有以下特异性引物：

上游外引物F3：5’-TCAGTGGCTAAAAGTCGGTC-3’；

下游外引物B3：5’-CGCACTGTGTCCAACAGC-3’；

上游内引物FIP：

5’-GTTACCTTGCCGGACGTCCCACTTTTGGTCTGAGCTACC-3’；

下游内引物BIP：

5’-AATGCGTTAATTCCGGAGGCGCCATGGCGATGGTTTGTT-3’；

上游环引物LF：5’-CCATCAATTGCGCGTTTCG-3’；