[发明专利]基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方法

权利要求书

1.一种基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于含有以下特异性引物：

上游外引物F3如SEQ ID NO.1所示，下游外引物B3如SEQ ID NO.2所示，上游内引物FIP如SEQ ID NO.3所示，下游内引物BIP如SEQ ID NO.4所示，上游环引物LF如SEQ ID NO.5所示，下游环引物LB如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括多孔板、无菌离心管、BPW培养液、无菌生理盐水、对照标准菌株DNA、LAMP反应体系试剂。

3.一种权利要求1所述基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒的非诊断性检测方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)制作检测沙门氏菌的环介导等温扩增试剂盒；

(2)样品制备和DNA提取；

(3)进行沙门氏菌的环介导等温扩增反应：按照LAMP反应体系对每个提取样品进行检测，依次确证沙门氏菌阳性管数；

(4)沙门氏菌MPN的报告：按照确证的沙门氏菌阳性管数，检索MPN表，报告每g或每mL样品中沙门氏菌的MPN值。

4.根据权利要求3所述基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒的非诊断性检测方法，其特征在于LAMP反应体系为：10X ThermoPol Buffer 2μL，MgSO₄ 1.2μL，dNTP Mixture 2.8μL，50X LAMP荧光染料0.2μL，ROX参比荧光染料0.2μL，10X Primers Mix 2μL，Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶0.8μL，DNA粗提液5μL，加无RNA酶水至20μL。

5.根据权利要求3所述基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒的非诊断性检测方法，其特征在于LAMP反应条件为：65℃保温反应40min，以1min作1个循环检测荧光值，结束后按65～95℃，0.2℃/s测定溶解曲线。

6.根据权利要求3所述基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒的非诊断性检测方法，其特征在于步骤(2)具体为：

(a)样品的前处理：

无菌操作称取样品，置于盛有BPW的无菌均质杯或合适容器内，均质；若样品为液态，不需要均质，振荡混匀；使用BPW增菌液对样品均液进行10倍梯度稀释，取3个浓度，每个浓度分别取1mL至3个离心管，置于36℃增菌5h后分别进行DNA提取；

(b)待测样品模板DNA的制备：

(b-1)对照标准菌株菌液制备：沙门氏菌标准菌株的DNA作阳性对照，大肠埃希氏菌DNA作为阴性对照，标准菌株接种于血平板中36℃培养24h进行活化，再接种于BPW培养基中36℃培养16h得到新鲜菌液；

(b-2)样品与对照菌株的模板DNA制备：采用快速煮沸法提取核酸，吸取1mL样液于12000r/min离心5min，移去上清液900μL，加入1mL无菌水后混匀再12000r/min离心5min，移去上清液900μL，置于100℃电热板中加热15min，迅速冷却后12000r/min离心1min，移取上清液直接用于LAMP实验；上清即作为模板DNA。