[发明专利]一种敲除人SLC25A12基因的细胞株及其应用

说明书

本发明公开一种敲除人SLC25A12基因的细胞株及其应用，属于分子生物学和细胞生物学技术领域。本发明提供一种靶向敲除人SLC25A12基因的gRNA序列，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。利用CRISPR‑Cas9技术首次在人Hela细胞基因组上敲除SLC25A12基因，获得SLC25A12敲除的Hela细胞株，且敲除细胞株活性、生长速度等方面均与对照细胞无明显差异，是较为理想的SLC25A12敲除的细胞模型；且操作简便，周期短，成本低，改造后细胞株稳定，可用于研究SLC25A12蛋白在糖胺聚糖代谢和蛋白质代谢等方面的具体作用机制。本发明获得的细胞株能够显著提高乙型脑炎病毒毒株的复制水平。

技术领域

本发明属于分子生物学和细胞生物学技术领域，具体涉及一种敲除人SLC25A12基因的细胞株及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展而来，包括三种不同的类型，其中TypeⅡ型的CRISPR/Cas系统的DNA内切酶Cas9只有一个亚基，结构最为简单，所以应用也最广泛。除了Cas9蛋白外，该系统还包括两条短的CRISPRRNAs(crRNAs)和trans-activating crRNAs(tracrRNA)。CRISPR/Cas9系统操作简单，切割效率高，因此被认有更好的应用前景。

慢病毒系统是以HIV-1为基础发展起来的一种基因转导工具。此系统能够在体内外介导分裂和非分裂细胞的有效转导和稳定表达。由于CRISPR/Cas9系统发挥功能需要Cas9蛋白和sgRNA的稳定表达，因此利用慢病毒载体将CRISPR/Cas9系统整合到宿主基因组中，能够稳定的发挥CRISPR/Cas9的功能，从而实现对靶基因的稳定敲除。溶质载体家族25成员12(Solute carrier family 25member 12)，简称SLC25A12，别名为Aralar1。SLC25A12基因为Ca²⁺依赖性线粒体天冬氨酸/谷氨酸载体(AGC)基因，位于2q24区域。所编码的AGC1是线粒体特有的蛋白质，SLC25A12表达的异常可影响线粒体的功能及ATP的合成，从而间接影响神经元的功能，还在在发育中的人类神经元组织中表达，与线粒体蛋白导入。主要的表达场所在于心脏和骨骼肌，在脑和肾脏中表达较弱。参与线粒体在病理生理条件下调节神经元稳态，能够调节MAVS信号通路的转导；SLC25家族蛋白参与能量代谢、细胞凋亡，且该家族成员还能在糖胺聚糖代谢、蛋白质代谢、氨基酸代谢和DNA合成等生物活动过程中也发挥重要作用。因此SLC25A12在不同类型细胞中的功能值得深入研究。

发明内容

为了克服现有技术的缺点并且弥补不足之处，本发明的第一个目的在于提供一种靶向敲除人SLC25A12基因的gRNA序列。

本发明的第二个目的在于提供一种靶向敲除人SLC25A12基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统。

本发明的第三个目的在于提供上述靶向敲除人SLC25A12基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种敲除人SLC25A12基因的细胞株。

本发明的第五个的在于提供上述敲除人SLC25A12基因的细胞株的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种靶向敲除人SLC25A12基因的gRNA序列，其核苷酸序列为：5′-AATATGTTTCTTAACTCATG-3′。

一种靶向敲除人SLC25A12基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统，含有上述靶向敲除人SLC25A12基因的gRNA序列。

上述靶向敲除人SLC25A12基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的构建方法，包括如下步骤：