[发明专利]实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源DNA自动删除的重组表达载体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源DNA自动删除的重组表达载体及其制备方法和应用，首先构建由家蚕生殖腺特异表达基因启动子调控GAL4基因表达的转基因激活载体和由UAS元件调控下游FLP基因表达的转基因效应载体，然后将转基因激活载体和效应载体分别转化家蚕并筛选单拷贝转基因家蚕建立激活系和效应系，再将激活系与效应系家蚕杂交获得双转基因杂交一代家蚕，最终获得基因组中不含目标外源DNA序列的后代家蚕，从而既可实现外源有益蛋白在转基因家蚕特定组织或器官中的表达，又可避免转基因在后代蚕种保留所带来的生物安全隐患。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源DNA自动删除的重组表达载体及其制备方法，还涉及利用该重组表达载体在转基因家蚕杂交一代生殖细胞中实现外源DNA自动删除的应用。

背景技术

科学界对转基因生物的安全性研究，主要集中于转基因植物特别是转基因农作物和转基因鱼类、贝类等水生动物以及转基因家禽、家畜等大型动物在食品、医药和农业等领域的安全评估研究，而对于具有重要科研与经济价值的农业昆虫安全转基因技术研究的报道则较为有限。近年来，随着转基因技术逐渐被广泛应用于家蚕(Bombyx mori)基因功能鉴定的基础研究和品种改良的应用研究领域，越来越多的研究人员意识到，转基因家蚕的生物安全问题是转基因家蚕新品种推广应用过程中不容忽视的关键问题。

家蚕作为非食用性的经济昆虫，其转基因安全问题主要体现在转基因操作技术安全方面。目前创制转基因家蚕的主要方法，仍旧是基于转座子(主要是piggyBac转座子)介导外源基因在基因组随机整合的家蚕种系转化技术。转座子随机整合所引起的诸如不可预知的基因表达变化、内源基因结构破坏、转基因个体生长发育受限等非预期负面效应，会严重影响转基因家蚕自身的安全。

此外，基于转座子系统建立的转基因家蚕，还存在3个方面的生态环境安全隐患问题：(1)筛选标记基因和转座子骨架等非目标基因序列在转基因家蚕基因组的保留；(2)转座子在家蚕基因组的不稳定整合现象；(3)携带外源基因的转基因蚕种在实际大规模推广应用过程中具有不可控性。在早期研究中，专利号为ZL201310181854.X的中国专利建立了一种基于phiC31/att系统的重组酶介导盒式交换(phiC31-RMCE)反应结合piggyBac转座子系统实现外源基因在转基因家蚕基因组预先确定的染色体位点(靶位点)精确定点整合/替换的策略。利用该策略不但能够克服piggyBac转座子随机整合可能引起的非预期负面效应对转基因家蚕生长发育带来不良影响的生物安全隐患，而且还有助于在一定程度上消除转座子随机整合位置效应和插入突变以及非目标基因序列对目标基因表达及基因功能研究的影响。2012年，西南大学Long等率先利用FLP/FRT位点特异性重组系统，成功实现了家蚕个体基因组水平筛选标记基因的定点删除。最近，Long等证实胚胎显微注射FLP重组酶mRNA和杂交引入FLP重组酶持续表达的方式，均能够有效提高FRT位点锚定的筛选标记基因在转基因家蚕基因组的定点删除效率，并进一步建立了基于FLP/FRT系统的转基因家蚕筛选标记基因的可诱导性定点删除技术。此外，专利号为ZL201510055652.X的中国发明专利公开了一种利用复合型piggyBac重组载体实现外源目标基因在家蚕基因组稳定整合、表达以及精确替换的方法，从而有效克服由转座子随机整合引起的转基因家蚕自身安全问题，以及由转座子整合不稳定性和非目标基因序列保留所带来的生态环境安全隐患问题。