[发明专利]实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源DNA自动删除的重组表达载体及其制备方法和应用

权利要求书

1.实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源DNA自动删除的重组表达载体，其特征在于，其为双元转基因表达载体，包括由家蚕生殖腺特异表达基因启动子调控GAL4蛋白表达的转基因激活载体和由UAS元件调控下游FLP基因表达的转基因效应载体这两部分；其中，转基因激活载体包括不同的2个，转基因效应载体为1个。

2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述转基因激活载体包括载体骨架、激活原件表达框和目的基因表达框。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体骨架为含有家蚕绿色眼荧光筛选标记的piggyBac重组载体pBac{3×P3-EGFPaf}；所述激活原件表达框包括家蚕生殖腺组织特异型基因启动子RSHP1p或Nanosp、优化型GAL4蛋白基因编码序列以及SV40终止子序列；所述目的基因表达框是以家蚕丝素重链启动子启动的红色荧光蛋白基因融合轻链结合位点序列组成。

4.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述转基因激活载体还包含用于锚定激活原件表达框的loxP位点和lox2272位点，锚定目的基因表达框的2个同向排列attP位点以及同时锚定激活原件表达框和目的基因表达框的2个同向排列的FRT位点。

5.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述转基因效应载体包括载体骨架、效应原件表达框和目的基因表达框。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体骨架为含有家蚕红色眼荧光筛选标记的piggyBac重组载体pBac{3×P3-DsRedaf}；所述效应原件表达框包括上游激活序列UAS元件、FLP基因编码序列以及SV40终止子序列；所述目的基因表达框是以家蚕丝素重链启动子启动的增强绿色荧光蛋白基因融合轻链结合位点序列组成。

7.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述转基因效应载体还包含用于锚定目的基因表达框的2个同向排列attP位点以及同时锚定效应原件表达框和目的基因表达框的2个同向排列的FRT位点。

8.权利要求1～7中任一项所述重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括：

(A)转基因激活载体的制备：通过无缝连接或酶切连接等手段，将FRT、loxP、RSHP1p、GAL4NFκB、SV40、lox2272、attP、Fibhp、DsRed、LBS、attP和FRT片段顺次连接至pSLfa1180fa载体，或者将FRT、loxP、Nanosp、GAL4NFκB、SV40、lox2272、attP、Fibhp、DsRed、LBS、attP和FRT片段顺次连接至pSLfa1180fa载体；通过AscI/FseI双酶切回收FRT-loxP-RSHP1p-GAL4NFκB-SV40-lox2272-attP-Fibhp-DsRed-LBS-attP-FRT，或者FRT-loxP-Nanosp-GAL4NFκB-SV40-lox2272-attP-Fibhp-DsRed-LBS-attP-FRT表达框片段，然后连接至AscI/FseI双酶切的pBac{3×P3-EGFPaf}载体骨架，即得；

(B)转基因效应载体制备：将FRT、UAS、FLP、SV40、attP、Fibhp、EGFP、LBS、attP和FRT顺次连接至pSLfa1180fa载体；通过AscI/FseI双酶切回收FRT-UAS-FLP-SV40-attP-Fibhp-EGFP-LBS-attP-FRT表达框片段，将其连接至AscI/FseI双酶切的pBac{3×P3-DsRedaf}载体骨架，即得到家蚕转基因效应载体pBac{3×P3-DsRed；FRT-UAS-FLP-SV40-attP-Fibhp-EGFP-LBS-attP-FRT}。

9.权利要求1～7中任一项所述重组表达载体在实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源DNA自动删除中的应用。

10.利用权利要求1～7中任一项所述重组表达载体制备杂交一代双转基因家蚕的方法，具体步骤如下：

(1)先将上述重组piggyBac转基因载体和辅助质粒pHA3PIG转化非滞育或解除滞育的G0代蚕卵，将孵化的G0代家蚕饲养至化蛾，将G0代蚕蛾回交制种以获得G1代蚕卵，在G1代家蚕中筛选单拷贝转基因家蚕，然后以蛾区为单位单独饲养即建立起2种不同的转基因激活品系和1种转基因效应品系；

(2)将步骤(1)筛选获得的单拷贝转基因插入的激活系家蚕与单拷贝转基因插入的效应系家蚕杂交制种获得杂交一代家蚕，筛选同时含有2种眼荧光标记的双转基因家蚕，即获得杂交一代双转基因家蚕；

(3)将步骤(2)中获得的杂交一代双转基因家蚕饲养至化蛾，将杂交一代双转基因雌雄蛾自交制种或者将其与非转基因家蚕回交制种获得杂交二代家蚕。由于生殖腺特异表达基因启动子调控GAL4蛋白在杂交一代双转基因家蚕的生殖细胞中特异性表达，进而激活FLP重组酶表达并实现位于同向排列FRT位点对之间激活原件表达框、效应原件表达框和目的基因表达框DNA序列的自动删除，因此最终获得的杂交二代家蚕基因组中将不含有激活原件表达框、效应原件表达框和目的基因表达框，确保消除外源目的基因在传代过程中可能发生逃逸的生物安全隐患；而在非生殖细胞中，由于生殖腺特异表达基因启动子不具有启动活性，无法调控GAL4基因表达，从而抑制了FLP重组酶表达，因此外源目的基因在非生殖细胞中得以保留，最终确保杂交一代双转基因家蚕表达转基因产物的获得及转基因产物经济性状的实现。