[发明专利]一种高效加尾快速扩增植物dsRNA病毒基因组末端序列的方法及其应用

说明书

本发明提供一种高效加尾快速扩增植物dsRNA病毒基因组末端序列的方法及其应用。该方法通过加热总RNA变性成单链RNA；对单链RNA的3'端加A尾；使用oligo(dT)₁₀‑RT将RNA逆转录成cDNA；以cDNA为模板将病毒基因组各分段的两端划分为5'端区域和3'端区域进行Multiplex PCR；跑胶回收目的条带并将其连接至克隆载体后进行测序，获得基因组的全部末端序列。该方法对样品的RNA质量要求低，oligo(dT)₁₀‑RT与Anchor₂₄‑F引物在dsRNA病毒基因组末端序列鉴定上可通同，适用于批量获得dsRNA病毒基因组末端序列，将有助于未知的dsRNA基因组全长序列的获得。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高效加尾快速扩增植物dsRNA病毒基因组末端序列的方法及其应用。

背景技术

已知的植物病毒中，大部分病毒是RNA病毒。双链RNA病毒（dsRNA）属于RNA病毒，因其核酸为互补的双链RNA而得名。绝大多数dsRNA病毒基因组是多分段，且每个分段都含有一个基因。

目前dsRNA提纯方法主要有以下3种：1、使用TRIzol试剂提取，这种方法提取的dsRNA质量较低；2、使用超速离心的方法，将提取的总RNA在氯化铯或者氯化锂进行密度梯度离心，最终获得提纯的dsRNA，该方法因提取dsRNA的量少，且成本高、操作复杂而被限制推广应用； 3、使用纤维素粉吸附dsRNA的纯化方法，是提取dsRNA病毒最常用的方法，但目前使用于dsRNA病毒纯化的纤维素粉（CF-11）已停产，而无法再正常使用，且使用此方法提取高质量dsRNA需投入以克计量的样品。

鉴定dsRNA病毒基因组末端序列的传统方法有2种：1、使用一段需双端修饰（5'端PO₄、3'端NH₂）的单链脱氧核苷酸“接头”连接于dsRNA 3'端，此连接过程只能使用T4 RNA连接酶,此酶的连接效率低下，且此方法对需要连接的dsRNA的纯度要求较高，不适用于只有少量病毒材料的样品，在提取高质量的dsRNA过程中，耗时长，操作复杂，提取出的dsRNA末端会出现部分碱基序列降解而无法获取到完整的dsRNA末端序列；2、使用SMARTer技术，在dsRNA的5'端加上一段核苷酸“接头”，才能将dsRNA片段的两个末端序列鉴定出，该方法需以高纯度dsRNA为模板，鉴定每个末端序列需再单独设计一个特性的反转录引物，实验过程复杂，整个实验成本高，但实验成功的效率低下，无法大范围推广。这两种传统方法，在每个末端序列鉴定时，都需要设计相对应的一个反转录引物进行反转录，且每次的反转录后的cDNA只能鉴定相对应的一个末端序列。

Poly(A)聚合酶具有很高的加尾效率，能够在RNA 3'端加入20 - 200个A碱基，Poly（A）聚合酶不依赖模板，可以催化ATP以AMP的形式依次掺入到RNA 3'末端，即在RNA 3'端加多聚腺苷尾，但Poly(A)聚合酶只能以单链RNA为模板。

Multiplex PCR又称多重引物PCR，此方法可以使用2对以上引物，通过PCR扩增产生2个以上的核酸片段。Multiplex PCR非常适合少量模板的样品使用，能够最大化提高模板的使用效率。

山茶潜隐病毒1 (CCV1）属于dsRNA病毒，其基因组由三分段的dsRNA所构成。由于茶叶含有多糖、多酚等次生代谢物，根据传统提纯dsRNA的方法，很难获得高质量的dsRNA，对于提取质量不好的RNA很难克隆到病毒基因组末端序列以及后续的实验，因此，需有一种对RNA质量要求一般且能高效扩增植物dsRNA病毒基因组末端序列的新方法。

南方水稻黑条水稻病毒 (SRBSDV) 属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)，其基因组由十分段的dsRNA所构成。由于SRBSDV的基因分段数比较多，使用常规分子克隆的方法很费时、费力才能获得完整的末端序列，因此，需有一种新的方法能够快速鉴定出多片段的末端序列。

发明内容