[发明专利]一种高效加尾快速扩增植物dsRNA病毒基因组末端序列的方法及其应用

权利要求书

1.一种高效加尾快速扩增植物dsRNA病毒基因组末端序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取植物总RNA；

（2）通过加热总RNA将dsRNA变性成单链RNA ；

（3）对单链RNA的3'端进行高效加多聚腺苷尾，得到加A尾的RNA，再纯化回收RNA；

（4）使用oligo(dT)₁₀-RT引物将RNA逆转录成cDNA，再纯化回收cDNA；

（5）以cDNA为模板将单分段或者多分段的dsRNA病毒的基因组的5'和3'末端统一划分为5'端区域和3'端区域进行Multiplex PCR，跑胶后回收目的条带，目的条带再连接至克隆载体后进行测序，最终得到完整的dsRNA病毒基因组末端序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述加热的条件为：90 ℃，3-5min，迅速插入冰上10 min以上。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中所述oligo(dT)₁₀-RT的引物序列如下：oligo(dT)₁₀-RT：5'-CACGCTCTCTACAGTCCGACGATCTTTTTTTTTTVN-3'。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中所述5'端区域和3'端区域各自进行Multiplex PCR，反应体系为：纯化cDNA 9 μL，2 × Multiplex Buffer 12.5 μL，5'-mix引物或3'-mix引物 2 μL，Anchor₂₄-F引物 1 μL，Multiplex DNA Polymerase 0.5 μL，总共25 μL；

所述Anchor₂₄-F引物序列为：5'-CACGCTCTCTACAGTCCGACGATC-3'；

所述5'-mix引物或3'-mix引物为：根据dsRNA病毒基因组单分段或者多分段的每一分段中长度大于100bp的序列设计引物；5'-mix引物由终浓度为0.2-0.4 μM的各分段的5'末端引物等体积混合而成；3'-mix引物由终浓度为0.2-0.4 μM的各分段的3'末端引物等体积混合而成。

5.如权利要求1所述方法在植物dsRNA病毒基因组末端测序中的应用。