[发明专利]海南省火焰兰SSR-PCR反应体系及其应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体公开了一种海南省火焰兰SSR‑PCR反应体系，包括Primer‑F、Primer‑R、DNA聚合酶、DNA模板。本发明还公开了上述海南省火焰兰SSR‑PCR反应体系在海南省火焰兰SSR分子标记及辅助育种中的应用，以及在制备检测试剂盒中的应用。本发明提供的海南省火焰兰SSR‑PCR反应体系稳定性佳，分辨率佳，可重复性高，能够扩增出清晰、明亮、特异的电泳条带，为后期引物的开发奠定重要的实验基础。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种海南省火焰兰SSR-PCR反应体系及其应用。

背景技术

火焰兰(Renanthera coccinea)为兰科万代兰族(Vandeae)指甲兰亚族(Aeridinae)火焰兰属 (Renanthera)植物，以其绚丽如火的花色而得名，是极具特色和观赏价值的一类热带珍稀兰花。火焰兰具有花序呈大圆锥型，花小数量多，花期长，花梗长，耐高温、高湿，喜阳等特点，可广泛用于切花、园林布景、绿篱和盆栽等方面。火焰兰属约有20个种，主要分布于亚洲的热带地区和太平洋岛屿。我国有云南火焰兰(R.imschooliana)、火焰兰和中华火焰兰(R.sinica)3种，主要分布于云南、贵州、海南等地。

目前，国内外对火焰兰的研究还主要集中在对云南火焰兰的离体快速繁殖(林丹妮等，2006)，种子无菌萌发和试管育苗(林丹妮等，2008)，杂交育种(曹雯静等，2014；陈和明等，2019)，通过查阅文献、标本记录、实地群落及种群现状调查相结合的方法来分析火焰兰的种群现状(李娟等，2018) 等方面。研究人员对海南省火焰兰资源的研究可能比较晚，仅发现在2015年才有报道，如姚婧通过相关序列扩增多态性(sequence-relatedamplified polymorphism,SRAP)技术对8份海南省火焰兰栽培资源进行了遗传多样性分析(姚婧，2015)，但是此项研究样本量比较少，而且样本并非海南省野生资源，SRAP标记的物种特异性不具优势，因此，不能反应整个海南省火焰兰的种质资源情况。

SSR(simple sequence repeat)分子标记具有多态性高、标记数量多、重复性好、覆盖面广等优点，已广泛应用于分子标记辅助选择、遗传多样性分析和遗传图谱构建等领域。目前常用的SSR标记开发策略有建库法、微卫星富集法、近缘物种引物筛选法和生物信息学分析法。其中，建库法作较复杂、开发效率低、对实验室设备仪器要求比较高、耗时长，只适用于对基因组信息了解非常少的物种进行标记开发；微卫星富集法与文库法相比省略了构建文库的步骤，但是该方法还需要用PCR的方法获得SSR分子标记的侧翼序列，操作更加繁琐；近缘物种引物筛选法，需要有近缘物种的SSR信息且对于亲缘关系较远的物种引物的通用性较差，在一定程度上限制了这种方法的应用；生物信息学分析法方法是采用软件在NCBI、EMBL据库中搜索EST序列中的SSR分子标记或者对已经完成基因组测序、转录组测序的物种进行搜索，找出其中的SSR分子标记，根据SSR分子标记的侧翼序列设计引物，利用样品对设计的引物进行筛选，从而筛选出含有SSR分子标记的具有多态性的引物。由于EST序列和转录组测序序列数据量很大，这种方法与其他SSR开发方法相比仍然具有很高的开发效率(夏峰梅,2016)。此外，这种方法开发的SSR位于基因的编码区，得到的SSR分子标记往往与基因紧密连锁，可以有效的进行基因定位和与性状的关联分析，得到功能性SSR分子标记。因此基于转录组数据开发的SSR标记不仅有利于对种质资源的遗传多样性评价，更有利于后期与重要性状进行关联分析，这也将为分子标记辅助育种工作中亲本选育过程节约了时间和成本。

采用转录组测序的策略开发分布于海南省火焰兰的SSR分子标记是对海南省火焰兰进行遗传多样性评价的有效手段，目前还尚未见有关海南省火焰兰资源遗传多样性的报道，而分子标记检测的首要条件是建立扩增条带很清晰的反应体系，为引物扩增的多态性的筛选及后期群体多态性分析奠定基础，目前这些方面也未见报道。

发明内容