[发明专利]用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的引物探针组、试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的引物探针组、试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。为进一步提高PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR联检的准确性，本发明提供了用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的引物探针组，以PRRSV的ORF6基因和CSFV的5′UTR非编码区作为扩增靶区域设计的针对PRRSV的引物探针组和针对CSFV的引物探针组，保证了检测基因位点的保守性和稳定性，引物探针组序列结构不存在相互作用，扩增效率和结合率高，具有很高的检测敏感性。本发明提供的检测试剂盒同相似病原体无交叉反应，具有较高的特异性和准确性，能满足大批量快速鉴别检测的要求。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的引物探针组、试剂盒及检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，简称PRRS)， 又称猪蓝耳病，主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV引起，可导致妊娠母猪严重繁殖 失败和各年龄猪的呼吸障碍，是一种严重影响养殖经济效益的猪传染病。古典猪瘟(Classical Swine Fever，简称CSF)，主要由猪瘟病毒CSFV引起，可导致猪群的高死亡 率和发病率，造成毁灭性的经济损失，被世界动物卫生组织OIE列为A类传染病。

由于猪繁殖与呼吸综合征和古典猪瘟均可不同程度的引起猪繁殖性障碍，并且常常混 合感染，因此仅凭临床症状、病理变化及流行病学调查很难做出准确诊断，尤其是在发病 的早期或潜伏期更难得到准确诊断。实时荧光定量PCR，即RT-PCR以其特异性强、灵敏度高、速度快等优点在基因表达水平分析、病原体基因的定性和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸快速检测的主要方法。

应用RT-PCR针对多种病毒进行同时联检时，不同病毒的引物、探针序列结构间如果 存在相互作用，极易对检测灵敏度和准确度造成负面影响，导致检测灵敏度的降低和结果 的不准确。同时病毒本身变异快、基因型和血清型多等因素也会影响RT-PCR联检的灵敏度和准确度。申请号为CN201110146877.8的发明专利《一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的 双色荧光定量PCR联合检测方法及其试剂盒》，可以实现在同一个待测样本中同时检测猪 瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒；但是，其猪繁殖与呼吸综合征检测的基因位点位于 ORF5基因，该基因存在高突变及同源重组。申请号为CN201510191676.8的发明专利《非 洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂及其方法 与用途》，在PRRSV的检测位点为NSP2，该位点同样保守性不高，甚至在高致病性猪繁 殖与呼吸综合征病中，NSP2基因还存在大量缺失。检测的基因位点如果发生突变或缺失， 甚至可能直接造成假阴性的检测结果，降低了NSP2变异株的特异性，对病猪的确诊造成 误导。

因此，在进行多种病毒RT-PCR同步联检时，检测基因位点的选择和不同病毒的引物 探针组序列结构是否相互作用是决定检测准确性的关键，然而兼具合适的检测基因位点和 稳定的引物探针组序列结构并不是根据病毒的基因序列能够显而易见得到的，仍然是本领 域亟需解决的技术难点。

发明内容

为进一步提高PRRSV和CSFV二重RT-PCR联检的准确性，本发明提供了用于 PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的引物探针组、试剂盒及检测方法。

本发明的技术方案：

一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的引物探针组，包括针对PRRSV 的引物探针组和针对CSFV的引物探针组；

所述针对PRRSV的引物探针组包括具有如下核苷酸序列的引物和探针：

正向引物PRRSV-D1-F：5′-ACCTGGAAATTCATCACCTC-3′；

反向引物PRRSV-D1-R：5′-CGACAAATGCGTGGTTATCA-3′；